一、檢驗程序

二、操作步驟

1、樣品的稀釋 

①固體和半固體樣品:稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內 ,8000r/min~10000r/min均質1min~2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1min~2min,制成1∶10的樣品勻液。

②液體樣品:以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶 (瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中充分振搖或置于機械振蕩器中振搖,充分混勻,制成1∶10的樣品勻液。

③樣品勻液的pH 應在6.5~7.5之間,必要時分別用1mol/LNaOH 或1mol/L HCl調節。

④用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖 液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復吹打,使其混合均勻,制成1∶100的樣品勻液。 

⑤根據對樣品污染狀況的估計,按上述操作,依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過程不得超過15min。 

2、初發酵試驗

每個樣品,選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種3管 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯,每管接種1mL(如接種量超過1mL,則用雙料LST肉湯),36 ℃±1℃培養24h±2h，觀察倒管內是否有氣泡產生，24h±2h產氣者進行復發酵試驗(證實試驗),如未產氣則繼續培養至48h±2h,產氣者進行復發酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。

3、復發酵試驗(證實試驗) 

用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物1 環,移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)管中，36 ℃±1 ℃培養48h±2h，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。

4、可能數(MPN)的報告

根據確證的大腸菌群BGLB陽性管數,檢索 MPN 表,報告每g(mL)樣品中大腸菌群的 MPN 值。 

一、檢驗程序：

1、樣品的稀釋 

按MPN法中的稀釋方法進行

2、平板計數 

①選取2個~3個適宜的連續稀釋度,每個稀釋度接種2個無菌平皿,每皿1mL。同時取1mL 生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。 

②及時將15mL~20mL融化并恒溫至46℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)約傾注于每個平 皿中。小心旋轉平皿,將培養基與樣液充分混勻,待瓊脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA 覆蓋平板表 層。翻轉平板,置于36 ℃±1 ℃培養18h~24h。 

3、平板菌落數的選擇 

選取菌落數在15CFU~150CFU 之間的平板,分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落 (如菌落直徑較典型菌落小)。典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環,菌落直徑為0.5mm 或更大,最低稀釋度平板低于15CFU 的記錄具體菌落數。

4、證實試驗 

從 VRBA 平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落,少于10個菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分別移種于 BGLB肉湯管內,36℃±1℃培養24h~48h,觀察產氣情況。凡BGLB肉湯管產氣, 即可報告為大腸菌群陽性

5、大腸菌群平板計數的報告 

經最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以計數的平板菌落數,再乘以稀釋倍數,即為每 g(mL)樣品中大腸菌群數。例:10^-4樣品稀釋液1mL,在 VRBA平板上有100個典型和可疑菌落,挑取其中10個接種BGLB肉湯管,證實有6個陽性管,則該樣品的大腸菌群數為:

100×6/10×10⁴/g(mL)=6.0×10⁵CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀 釋倍數計算。

備注: 

6.0×10⁵CFU/g(mL)也 就是600000CFU/g(mL)這個作為公司統一的數據修約后的報告方式，若均無菌落生長則報告值為<10CFU/g(mL)

例: 10^-2樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有90個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有10個陽性管,則該樣品的大腸菌群數為: 90×10/10×10²/g(mL)=9000CFU/g(mL)