通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯致密，故遇乙醇脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現縫隙，因此能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經番紅等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。
 

二、步驟
 

  革蘭氏染色法的步驟為：涂片→固定→結晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脫色→番紅復染→水洗→干燥→觀察。

1、涂片 

  首先在載玻片上滴一小滴蒸餾水，用灼燒過的接種針挑取少量細菌，置于載玻片的水滴中與水混合并涂抹開。注意涂抹要均勻平坦，涂抹成直徑約為1 cm的薄層。　

2、固定

  將載玻片在火焰上方快速來回通過一兩次，以載玻片的加熱面接觸手背皮膚，不覺過燙為佳；待冷卻后再在火焰上方來回通過一兩次，再冷卻，重復操作直到薄層變干。

3、結晶紫染色 

  染色1分鐘，然后水洗并用吸水紙吸干。

  碘液媒染 染色1分鐘，然后水洗并吸干。

4、酒精脫色

  用95%酒精脫色，直到酒精不出現紫色時即停止（大約半分鐘），然后立即水洗，并吸干。

5、番紅復染 

  染色3分鐘左右，然后水洗并吸干。

6、鏡檢

  在顯微鏡油鏡頭下觀察，菌體顯藍紫色的為革蘭氏陽性菌；菌體顯紅色的為革蘭氏陰性菌。
 

三、結果
 

  染色結果革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

四、意義

1、鑒別細菌 

2、選擇藥物 

3、與致病性有關

  革蘭氏陽性菌能產生外毒素，革蘭氏陰性菌能產生內毒素；而內毒素主要是指革蘭氏陰性菌胞壁成分中的脂多糖，兩者的致病作用不同。
 

五、注意事項
 

1、注意涂片不宜過厚，勿使細菌密集重疊，影響脫色效果，否則脫色不完全造成假陽性。鏡檢時應以視野內分散細胞的染色反應為標準。

2、火焰固定溫度要適宜，以玻片不燙手為宜，否則菌體細胞變性。

3、滴加染色液與酒精時一定要覆蓋整個菌膜，否則部分菌膜未受處理，亦可造成假象。

4、乙醇脫色是革蘭氏操作的關鍵環節。如脫色過度，則G+被誤染成G-菌，而脫色不足，G-被誤染成G+菌。在染色方法正確無誤的前提下，如菌齡過長、死亡或細胞壁受損傷的G+也會呈陰性反應，故革蘭氏染色用要對數生長期的幼齡培養物。

5、染色過程的時間控制。應根據季節、氣溫調整。一般冬季時間可稍微長些，夏季可稍微短些。