蠟樣芽胞桿菌及檢驗

發布日期：2010-05-11

核心提示：　　在《Bergey氏鑒定細菌學手冊》第8版中，蠟樣芽胞桿菌的分類地位為芽胞桿菌屬的第I群，該群有22個種。根據營

　　在《Bergey氏鑒定細菌學手冊》第8版中，蠟樣芽胞桿菌的分類地位為芽胞桿菌屬的第I群，該群有22個種。根據營養型菌細胞的寬度分為兩類，蠟樣芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌和巨大芽胞桿菌屬“大細胞菌種”。

　　1950年Hauge在對挪威奧斯陸某醫院職工和病員進食甜食后引起的食物中毒研究中，首次明確指出蠟樣芽胞桿菌的致病作用。

一、生物學特性

1、形態特性

　　蠟樣芽胞桿菌為革蘭氏陽性大桿菌，大小為1-1.3×3-5μm，兼性需氧，形成芽胞，芽胞不突出菌體，菌體兩端較平整，多數呈鏈狀排列，與炭疽桿菌相似。引起食物中毒的菌株多為周鞭毛，有動力。

2、培養特性

　　蠟樣芽胞桿菌生長溫度為25-37℃，最佳溫度30-32℃。在肉湯中生長混濁有菌膜或壁環，振搖易乳化。在普通瓊脂上生成的菌落較大，直徑3-10mm，灰白色、不透明，表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣常呈擴展狀。偶有產生黃綠色色素，在血瓊脂平板上呈草綠色溶血。在甘露醇��卵黃多粘菌素（MYP）平板上，呈伊紅粉色菌落。

3、生化特性

表1：蠟桿芽胞桿菌的生化特性及其與近緣菌的鑒別

特性	蠟樣芽胞桿菌	蘇云金桿菌	蕈狀芽胞桿菌	炭疽桿菌	巨大芽胞桿菌
革蘭氏染色	+a	+	+	+	+
過氧化氫酶	+	+	+	+	+
動力	+/-b	+/-	-c	-	+/-
硝酸鹽還原	+	+/-	+	+	-d
分介酪氨酸	+	+	+/-	-d	+/-
抗溶菌酶	+	+	+	+	-
卵黃反應	+	+	+	+	-
厭氧利用葡萄糖	+	+	+	+	-
VP反應	+	+	+	+	-
甘露醇產酸	-	-	-	-	+
溶血（羊紅細胞）	+	+	+	-d	-
已知致病特性	產腸毒素	晶體內毒素對昆蟲致病	根狀生長	人畜共患

a+，90-100% 菌株是陽性；

b+/-，50-50% 菌株是陽性；

c-， 90-100% 菌株是陰性；

d-，絕大多數菌株是陰性。

4、耐熱性

　　蠟桿芽胞桿菌耐熱，其37℃16小時的肉湯培養物的D80℃值（在80℃時使細菌數減少90%所需的時間）約為10-15分鐘；使肉湯中細菌（2.4×10⁷/mL）轉為陰性需100℃20分鐘。其游離芽胞能耐受100℃30分鐘，而干熱滅菌需120℃60分鐘才能殺死。

二、流行病學

1、細菌分布

　　蠟樣芽胞桿菌在自然界分布廣泛，常存在于土壤、灰塵和污水中，植物和許多生熟食品中常見。已從多種食品中分離出該菌，包括肉、乳制品、蔬菜、魚、土豆、糊、醬油、布丁、炒米飯以及各種甜點等。

　　在美國，炒米飯是引發蠟樣芽胞桿菌嘔吐型食物中毒的主要原因；在歐洲大都由甜點、肉餅、色拉和奶、肉類食品引起；在我國主要與受污染的米飯或淀粉類制品有關。

2、流行情況

　　蠟樣芽胞桿菌作為一種食源性疾病的報導較多，在各種食品中的檢出率也較高，如1982年犬飼等對日本名古屋所采1641份食品樣品中，有193份檢出了該菌、陽性率為11.8%；1984年我國有關單位對南京市所采211份食品樣品中，有81份檢出了該菌，陽性率為38.4%。

　　蠟樣芽胞桿菌食物中毒通常以夏秋季（6-10月）最高。引起中毒的食品常于食前由于保存溫度不當，放置時間較長或食品經加熱而殘存的芽胞以生長繁殖的條件，因而導致中毒。中毒的發病率較高，一般為60-100%。但也有在可疑食品中找不到蠟樣芽胞桿菌而引起食物中毒的情況，一般認為是由于蠟桿芽胞桿菌產生的熱穩定毒素所致。1985年9月，美國緬因州的健康局報導了在一家日本餐館發生了食物中毒而導致的胃腸炎事件，經調查所有的食品其加工和儲藏都是規范的，僅用剩飯制作的炒飯其是冷藏儲放還是在室溫放置說不清楚，在炒飯中雖然找不到活的蠟樣芽胞桿菌，但是完全可能存在重新加熱過程中消除了活菌而沒有破壞熱穩定毒素的可能性。

3、臨床癥狀

　　當攝入的食品其蠟樣芽胞桿菌數量達>10⁶/克時常可導致食物中毒。

　　蠟樣芽胞桿菌食物中毒在臨床上可分為嘔吐型和腹瀉型兩類。嘔吐型的潛伏期為0.5-6小時，中毒癥狀以惡心、嘔吐為主，偶而有腹痙攣或腹瀉等癥狀，病程不超過24小時，這種類型的癥狀類似于由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒。腹瀉型的潛伏期為6-15小時，癥狀以水瀉、腹痙攣、腹痛為主，有時會有惡心等癥狀，病程約24小時，這種類型的癥狀類似于產氣莢膜梭菌引起的食物中毒。

三、致病性

　　蠟樣芽胞桿菌引起食物中毒是由于該菌產生腸毒素。它產生兩種性質不同的代謝物，引起腹瀉型綜合癥的是一種大分子量蛋白；而引起嘔吐型綜合癥的被認為是一種小分子量、熱穩定的多肽。

　　致嘔吐型綜合癥的腸毒素至今尚未提純，致腹瀉型綜合癥的腸毒素已提純，其純化的腸毒素分子量為55-6.0×10³。致腹瀉的腸毒素能使小白鼠致死。

表2：蠟樣芽胞桿菌腹瀉和嘔吐毒素的性狀

性狀	腹瀉毒素	嘔吐毒素
分子量	55-6.0×10³	<5000
穩定性	56℃ 5分鐘、pH3或11 毒性消失	115℃10分鐘、pH2或11.2小時毒性殘存
活性	致猴腹瀉對胰蛋白酶敏感	致猴嘔吐對胃蛋白酶、胰蛋白酶耐受
抗原性	特異性抗體中和試驗陽性	無抗原性

四、檢驗和控制

A、樣品制備

　　無菌操作稱取樣品50g放入滅菌攪拌缸內。加Butterfield�s磷酸鹽緩沖稀釋液450mL，以高速（18.000-21.000rpm）均質2min。用上述1:10稀釋液，連續稀釋供蠟樣芽胞桿菌計數。

B、蠟樣芽胞桿菌平板計數

　　移取10mL均質樣液（1:10稀釋）加到90mL空白液中，從10^-2到10^-6制備一系列稀釋液，充分混勻，并繼續稀釋直到10^-6為止。取樣品的各個稀釋液（包括1:10）0.1mL接種2只MYP（甘露醇一卵黃多粘菌素瓊脂）平板，用滅菌玻璃棒在每只平板表面涂布均勻。將平板置30℃培養24小時，并檢查菌落周圍有沉淀圈者，表示產生卵磷脂酶。蠟樣芽胞桿菌菌落通常是粉紅色，隨著培養時間的延長則更明顯。如果上述反應不清晰，應將平板再培養24小時后計數，從MYP平板上挑取典型菌落5個或更多，移種到營養瓊脂斜面上供蠟樣芽胞桿菌證實試驗用。

C、蠟樣芽胞桿菌的最大近似數

　　MPN技術被推薦用于食品中低于10個/g蠟樣芽胞桿菌的檢驗。某些不適合用平板計數法的脫水淀粉類食品也可用此法檢驗。

　　在胰酪胨大豆多粘菌素肉湯中接種3管MPN系列，10^-1、10^-2、10^-3的稀釋液各接種1mL于3管。將培養管置30℃培養48±2小時，檢查生長密集、典型的蠟樣芽胞桿菌。將陽性管培養物劃線接種于MYP平板，于30℃培養24-48小時。以下步驟同B。

D、蠟樣芽胞桿菌的證實試驗

　　從MYP瓊脂平板上挑取5個或更多的伊紅粉色，卵磷脂酶陽性的菌落，移種到營養瓊脂斜面上，置30℃培養24小時。取培養物作了革蘭氏染色和顯微鏡觀察。再用3mm直徑的接種環取培養物到裝有0.5mL滅菌磷酸緩沖稀釋液的13×100mm試管中，充分混懸均勻。用于下列試驗。

·酚紅葡萄糖肉湯

·硝酸鹽肉湯

·改良的V-P培養基

·酪氨酸瓊脂

·溶菌酶肉湯

·MYP瓊脂

　　蠟樣芽胞桿菌的分離物應符合下述條件。