PAP復合物是離體制備的HRP抗HRP復合物，它的制備方法較多，現簡介其中之一。

（1）制備抗HRP血清：健康雄性家兔（2．Okg以上），可先于足趾皮下注射滅活的卡介苗（共lOmg），2周后重復1次，刺激機體免疫系統功能，1周后于背部脊柱兩旁皮內多點注射1．Oral乳劑[福氏完全佐劑，含HRP3。3mg（RZ＝3．0）L間隔2周第2次注射，背部注入含3．3mg HRP的不完全福氏佐劑1．0ml；再間隔2周，第3次注射，2mgHRP（溶于2ml生理鹽水中），分別于前后小腿皮下和背部肌肉內多點注射，1周后采靜脈血，檢查效價。再隔1周第4次加強注射（條件同第3次），1周后檢查抗體效價，瓊脂糖擴散法（HRP 0．1mg／m1）為1：128以上時，頸動脈取血，制備血清低溫保存備用。

（2）制備PAP復合物：離體條件下，使兔抗HRP抗體與HRP形成可溶性復合物。在制備抗HRP血清時，HRP的純度要高（RZ≥3），而制備PAP復合物時，HRP的質量要求不高，甚至可用酶的粗制品。主要步驟如下：

①取HRP血清，力D 7．6ml含7．6mgHRP（1。0mg／m1）的水溶液。

②混勻，室溫1h后，4℃環境下離心16 000r 15min。

③0．9％NaCI（冷鹽水）溶解沉淀，4℃環境下離心16 000r15min，重復4次。

④加15．3ml HRP水溶液，在室溫下持續攪拌。

⑤用lmol／L及0．1mol／l HCl調pH至2．3，當沉淀物全部溶解變清，立即用lmol／L NaOH調pH至7．2[1N怨（mol／L×離子價數）]。

⑥慢慢加入等體積的飽和硫酸銨，0℃環境下放置45min。

⑦離心35 000r 0℃15min，沉淀用50％硫酸銨漂洗兩次。

⑧用10．5ml水溶解沉淀，對透析液[48．6g NaCl，1．5mol／I。NaOOCCH，30ml，3mol／L（NH+）2804 30ml，水5．94L]透析，4℃環境下離心，收集上清液，加透析液使體積至10．5ml，分裝低溫保存。

（3）PAP復合物的質量鑒定：制備的PAP復合物應檢測酶和抗體的含量，以鑒定PAP復合物的質量。常用分光光度計檢測PAP的復合物在280nm（1gG的最大吸收波長）和400nm（HRP的最大吸收波長）的光密度值（OD值），按下式計算IgG和HRP的含量。

一般HRP／抗HRP的克分子比達1．9時，可分裝冷藏于一85’C冰箱。由于稀釋后的PAP復合物不穩定，4℃環境下只能保存2～3周。因此，最好臨用前配制。

（4）PAP復合物的特征：PAP復合物的形成不同于其他抗原抗體反應，在抗原稍過量時，所有的抗HRP抗體均參與形成可溶性PAP復合物，僅殘留少許游離的HRP，而大多數抗原抗體反應需要抗原絕對過量才能形成可溶性復合物。PAP復合物的形狀相當穩定，不受抗原量的影響，無論最初加入的抗原抗體過量與否，最終形成的PAP復合物其HRP與抗HRP之比絕大部分為3；2。應用離心沉降、液相擴散等方法分析表明：PAP復合物沉降系數為11．5s，分子量為400—430kD，由此可推算出酶與抗體之比為3：2，即每個PAP生命物由3個HRP分子和2個抗HRP抗體組成，呈五角形結構，3個角為HRP，另兩個角為抗HRP抗體。采用H2O2—DAB染色，電子顯微鏡下已經觀察到PAP復合物五角形環狀結構，直徑平均21nm。這種結構異常穩定。據報道PAP復合物的抗HRP抗體與HRP結合常數為108，在此可溶性復合物中，即使存在少量游離HRP，亦不影響其穩定性。

（5）PAP染色原理：與酶橋法相似，都是借助橋抗體將酶連結在與組織抗原結合的第1抗體上，所不同的是PAP法將酶橋法的步驟3和步驟4合并為一步，用PAP復合物代替，即第3步用PAP復合物孵育切片，故稱PAP法。PAP復合物中的抗HRP抗體和第1抗體為相同種屬動物的IgG，所以橋抗體能夠作為“橋”將PAP復合物連結在第1抗體上。

（6）PAP染色步驟：主要步驟與酶橋法相似。

PAP法主要染色步驟

①切片準備及第1抗體孵育前處理同間接法；切片與特異性第1抗體孵育同酶橋法。

②用過量的橋抗體孵育，作用同酶橋法。

③用離體制得的PAP復合物（1：30～300稀釋）孵育1～1．5h（室溫），使其被橋抗體連結在第1抗體上。亦可用ALP抗ALP復合物代替。

④顯色觀察同間接法。