1.機械刮除法:
是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲)、或裹少許脫脂棉制成,裝入試管中高壓滅菌后備用(也可用特制電熱燒灼器刮除)。刮除程序為:
(1)標記:鏡下觀察,用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位;
(2)刮除:棄掉培養液,把無菌膠刮伸入瓶皿中,肉眼或顯微鏡窺視下,刮除無標記空間;
(3)用Hanks液沖洗一兩次,洗除被刮掉的細胞;
(4)注入培養液繼續培養,如發現仍有成纖維細胞殘留,可重復刮除至完全除掉為止
2.反復貼壁法:
根據腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點,并結合使用不加血清的營養液,把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁,使兩類細胞相互分離,操作方法與傳代相同。
(1)待細胞生長達一定數量后,倒出舊培養液,用胰酶消化后,Hanks 沖洗2次,加入不含血清的培養液,吹打制成細胞懸液;
(2)取編號為此A、B、C三個培養瓶;首先把懸液接種入A培養瓶中。置溫箱中靜止培養5~20分鐘后,輕輕傾斜培養瓶,讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養液,再接種入B培養瓶中后;向A瓶中補充少許完全培養液置溫箱中繼續培養;
(4)培養B瓶中細胞5~20分鐘后,接處理A的方法,把培養液注入C培養瓶中;再向B瓶中補加完全培養基。
當三個瓶內都含有培養液后,均在溫箱中繼續培養。如操作成功,次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞,B瓶兩類細胞相雜,C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復處理多次,直至癌細胞純化為止。
3.消化排除法:
此法曾用于乳癌細胞的培養,具體程序是:
(1)先是用0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培養細胞一次,然后再換成新的混合液繼續消化,并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養瓶,到半數細胞脫落下來后,便立即停止消化;
(2)把消化液吸入離心管中,離心去上清,吸入另瓶中,加培養液置溫箱中培養;向原瓶內也補加新的培養液繼續培養。用此法處理后,成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經過幾次反復處理,可能把成纖維細胞除凈。
4.膠原酶消化法:
本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點,通過消化進行選擇。
(1)可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理,邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視,當發現成纖維細胞被除掉后,即終止消化;
(2)用Hanks洗滌處理一次后,更換新培養液,繼續培養,可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈,可再次重復。
5.其它方法:
有人發現聚丙烯酰胺有抑制成纖維細胞生長的作用;也有人用聚蔗糖制備成比重1.025~1.085的密度梯度離心液,加入細胞懸液后,在23℃中800g離心 10分種。在比重1.025~1.050層為成纖維細胞,在比重1.050~1.085層為上皮細胞,再經過分離進行培養。最近也有人應用特殊化學物如SOD抑制成纖維細胞生長的方法。
選用上述任何一種方法,都需進行試驗,取得必要經驗,找出適合的條件,才能獲得好的效果。
是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲)、或裹少許脫脂棉制成,裝入試管中高壓滅菌后備用(也可用特制電熱燒灼器刮除)。刮除程序為:
(1)標記:鏡下觀察,用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位;
(2)刮除:棄掉培養液,把無菌膠刮伸入瓶皿中,肉眼或顯微鏡窺視下,刮除無標記空間;
(3)用Hanks液沖洗一兩次,洗除被刮掉的細胞;
(4)注入培養液繼續培養,如發現仍有成纖維細胞殘留,可重復刮除至完全除掉為止
2.反復貼壁法:
根據腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點,并結合使用不加血清的營養液,把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁,使兩類細胞相互分離,操作方法與傳代相同。
(1)待細胞生長達一定數量后,倒出舊培養液,用胰酶消化后,Hanks 沖洗2次,加入不含血清的培養液,吹打制成細胞懸液;
(2)取編號為此A、B、C三個培養瓶;首先把懸液接種入A培養瓶中。置溫箱中靜止培養5~20分鐘后,輕輕傾斜培養瓶,讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養液,再接種入B培養瓶中后;向A瓶中補充少許完全培養液置溫箱中繼續培養;
(4)培養B瓶中細胞5~20分鐘后,接處理A的方法,把培養液注入C培養瓶中;再向B瓶中補加完全培養基。
當三個瓶內都含有培養液后,均在溫箱中繼續培養。如操作成功,次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞,B瓶兩類細胞相雜,C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復處理多次,直至癌細胞純化為止。
3.消化排除法:
此法曾用于乳癌細胞的培養,具體程序是:
(1)先是用0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培養細胞一次,然后再換成新的混合液繼續消化,并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養瓶,到半數細胞脫落下來后,便立即停止消化;
(2)把消化液吸入離心管中,離心去上清,吸入另瓶中,加培養液置溫箱中培養;向原瓶內也補加新的培養液繼續培養。用此法處理后,成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經過幾次反復處理,可能把成纖維細胞除凈。
4.膠原酶消化法:
本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點,通過消化進行選擇。
(1)可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理,邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視,當發現成纖維細胞被除掉后,即終止消化;
(2)用Hanks洗滌處理一次后,更換新培養液,繼續培養,可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈,可再次重復。
5.其它方法:
有人發現聚丙烯酰胺有抑制成纖維細胞生長的作用;也有人用聚蔗糖制備成比重1.025~1.085的密度梯度離心液,加入細胞懸液后,在23℃中800g離心 10分種。在比重1.025~1.050層為成纖維細胞,在比重1.050~1.085層為上皮細胞,再經過分離進行培養。最近也有人應用特殊化學物如SOD抑制成纖維細胞生長的方法。
選用上述任何一種方法,都需進行試驗,取得必要經驗,找出適合的條件,才能獲得好的效果。