動物的選擇
目前應用最廣的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠為好。就品系而言以Balb/c小白鼠應用最廣，因為所有的小白鼠骨髓瘤系均從Balb/c小白鼠系誘導出來。Balb/c系小白鼠必須用純系的，雌雄均可，以8~12周齡為宜。
大白鼠也可，能產生較多量的單克隆抗體。現在已經在小鼠雜交瘤的基礎上，發展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人雜交瘤技術。
免疫
一般而言，抗原的純度不很重要，特別是免疫原性較強的抗原。
免疫程序、劑量和方法是關系到是否能得到所需要的單克隆抗體的關鍵之一。
正常小鼠脾臟含有能產生各種不同抗體的B淋巴細胞，一只純種小白鼠估計能產生1.0×107~5.0×107種不同的抗體。因此一只正常的小白鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤融合，只能有千萬分之一的機會獲得某一種特定抗體。所以為了提高得到某種雜交瘤的機會，必須加強免疫，使產生特異性抗體的B淋巴細胞大量增加。
B淋巴細胞的不同發育階段對獲得陽性雜交瘤也有很大影響。有人認為處在轉化時期的B淋巴細胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，雖然是抗體產生的高峰時期，但形成有活力的雜交瘤細胞的可能反而減少。故一般認為加強免疫后的第三天應殺鼠取脾做細胞融合。
1．可溶性抗原（蛋白質） 以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐劑乳化，分多點小鼠皮下注射，總量為0.3ml～0.6ml，間隔３～５周再同樣注射一次，１０天后，斷尾取血一滴，測抗體效價，選滴度高的小鼠做融合試驗。一個月后可以經靜脈（尾靜脈）給予無佐劑抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，殺死小鼠取脾做融合用。
２.顆粒性抗原 如抗原來源方便，可以不加佐劑而增加免疫次數，縮短間隔時間。例如用羊紅血球免疫小白鼠，以１％濃度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。有人認為最后一次免疫劑量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。