又稱孟德爾第一定律。生物體在形成配子過程中，位于某對同源染色體的一對等位基因，隨著同源染色體的分開而彼此分離，并進入不同的配子中，獨立地隨配子傳遞到后代。例如將開紅花的純系豌豆品種與開白花的純系豌豆品種進行雜交，其F1全部表現為開紅花，F1自交所得的F2中有705株開紅花，224株開白花，兩者數目之比大致為3∶1。豌豆的其他6對相對性狀均有類似結果，如下表所示：
它們的共同點是：（1）F1只表現某一親本的性狀（顯性性狀）；另一親本的性狀（隱性性狀）則不表現。（2）在F2，雜交親本的相對性狀——顯性性狀和隱性性狀均得以表現，二者之比約為3∶1。對此，孟德爾提出遺傳因子假說來解釋，其要點是：（1）相對性狀的遺傳由相對的遺傳因子（現稱為基因）控制。例如，在豌豆花色試驗中，遺傳因子C控制開紅花，而遺傳因子c則控制開白花，C對c呈顯性。（2）遺傳因子在體細胞中成對存在，每對因子中1個來自父本，另一個來自母本。豌豆開紅花顯性親本的遺傳型為CC，開白花隱性親本為cc，F1為Cc，由于C對c為顯性，所以F1表現為開紅花。（3）雜合體（如Cc）的遺傳因子彼此不融合而保持相對獨立，在形成配子時，成對遺傳因子彼此分離，進入不同的配子，因此每個配子只含有成對因子中的一個成員，于是產生了數目相等的兩種配子，即C配子和c配子。（4）雌、雄配子的結合是隨機的，按概率法則，各類合子出現的概率是雌、雄配子概率的乘積。
F2代的遺傳構成為1/4CC、2/4Cc、1/4cc，但由于CC和Cc都開紅花，所以，開紅花與開白花個體數之比為3∶1。可見分離規律的實質是：兩個不同的等位基因分別位于一對同源染色體上，在形成配子時，等位基因隨著同源染色體的分開而彼此分離，分別進入不同的配子，產生兩種數目相等的配子，雌、雄配子的隨機結合，使F2的基因型比例數為1∶2∶1，而表現型個體數之比是3∶1。為驗證F1在形成配子時確實由于等位基因的分離而產生C和c兩種數目相等的配子，孟德爾首創了測交法，即把待測的雜合體與隱性親本進行測交。如果F1在形成配子時等位基因確實分離，那么測交后代的開紅花數與開白花數之比應為1∶1，實驗結果果然如此：
孟德爾對7對相對性狀均做了測交，測交后代的顯性個體數與隱性個體數之比均為1∶1，與預期結果相符，從而說明他的遺傳因子假說是正確的。分離規律在生物界有普遍意義，各國學者用動、植物做了許多雜交試驗，都得到類似于孟德爾的結果。例如，用純合體的黑色豚鼠CC與白色豚鼠cc雜交，其F1均為黑色，F1互交產生的F2群體中出現黑色個體數：白色個體數為3∶1。又如在人群中，有耳垂者的基因型為AA或Aa，無耳垂者為aa，綜合分析多個雙親均為雜合體的家庭子女的耳垂性狀，發現有耳垂者與無耳垂者數目之比亦為3∶1。
分離規律的出現是有條件的，這些條件是：（1）研究的對象必須是行有性生殖的二倍體生物，所研究的性狀為質量性狀。（2）控制性狀的顯性基因對隱性基因呈完全顯性，并且非等位基因之間無互作。（3）減數分裂時，該基因座上的兩個等位基因必須分開到不同的子細胞中，所形成的兩類配子數目相等，受精時各類雌雄配子隨機結合。（4）受精卵或由受精卵發育而成的個體具有同樣的成活率。（5）分析的群體必須比較大或試驗次數較多。有時上述條件都得到滿足，在F2中仍會出現偏離3∶1的現象，這是由于隨機抽樣誤差和概率分布（因理想群體中各類型的出現是由機率決定的，因而出現實得比例在預期比例左右波動的現象）等原因所致。
掌握分離規律有助于正確認識生物遺傳現象。在動、植物良種培育工作中，利用分離規律可促使個體基因的分離和個體基因型的純合化，從中選出符合育種目標的遺傳上穩定的類型。例如有些作物（如小麥）的抗病性有的是由顯性基因控制的（R表示抗病基因，r表示感病基因），表現為抗病植株的基因型為RR或Rr，為選出抗病的純合植株，須將選得的抗病植株自交后加以考查，看其后代是否分離，如不分離，才能選出RR型純合株，以保證它們的后代是抗病的。分離規律也是醫學和優生學的理論基礎。據統計，目前已發現的遺傳病近5000種，遺傳病患者占人口的10％，其中大部分為單基因遺傳病，應用分離規律可探索這類遺傳病的發病特點，以便作出準確診斷和采取相應防治措施。例如，人結腸息肉病是單基因顯性遺傳病，并且可能導致癌變，先證者往往是雜合子，如果與正常人婚配，根據分離規律可預測其子女的發病率為1/2，因此應及早對其子女進行鋇餐透視，采取措施以避免結腸癌變的發生。
