轉基因動物實驗技術

1980年底Gordon等人首次將克隆的基因注入小鼠受精卵原核，然后移植于假孕的母鼠輸卵管,培育出第1個轉基因動物。這種將外源性基因用實驗方法插入動物生殖細胞的基因組而獲得具有插入基因特性，并能正常繁衍的動物稱為轉基因動物 ( transgenicanimals)。轉基因技術是生物學領域最新重大進展之一，已能滲透到生物學、醫學、畜牧學等學科的廣泛領域。轉基因動物已成為探討基因調控機理、致癌基因作用和免疫系統反應的有力工具。同時人類遺傳病的轉基因動物模型的建立，為遺傳病的基因治療打下堅實的理論和實驗基礎。
轉基因技術涉及外源基因的組建、載體、受體、基因導入技術、供轉基因胚胎發育的體外培養系統和宿主動物等方面的內容。
一、轉移基因
(一)轉移基因的原理：轉基因技術的理論基礎在于各種生物的遺傳密碼都是統一的。都是以3個堿基決定一個氨基酸這樣的密碼形式貯存在DNA鏈上，各物種間形狀的不同僅僅是由于DNA上的四種核苷酸排列次序的不同，同時各種生物從DNA到蛋白質合成都服從“中心法則”,當一個物種的細胞內加入另一物種或人工合成的DNA(即基因)后就可能產生新的性狀。
(二)基因的獲得：取自現有的生物體如病毒、細菌、體細胞或腫瘤細胞的DNA,用限制內切酶或外切酶把DNA切割成若干小段,然后再把這些小段利用連接酶分別放入載體中,并建成載體克隆。載體通常是一種獨立的，能自我復制的遺傳物質，如質粒、某些噬菌體和病毒均可作為載體。基因的片斷可隨載體復制，有時亦可表達，用DNA 或抗體探針做分子雜交試驗或ELISA試驗篩選出帶有理想基因的克隆,再把理想基因載體放入大腸桿菌等宿主細胞中擴大、增殖,或采用PCR的方法擴增。再對擴增的DNA片斷進行適當修飾,例如將一個單一的基因與經選擇的啟動子重組合，然后進行轉移，或將特定的控制序列連接到目的基因的結構序列上，從而創造1個新的重組基因,然后再進行轉移。
理想基因也可用人工合成的辦法獲得，要合成一特定的基因，就是要合成具有一定排列順序的DNA，DNA上四種堿基的配對是非常嚴格的,腺嘌呤(A)必定和胸腺嘧啶(T) 配對，鳥嘌呤(G)必定和胞嘧啶(C)配對，由于蛋白質合成不是直接以DNA作為模板,而是以DNA的副本mRNA作為模板，在RNA中，用尿嘧啶(U)代替了胸腺嘧啶(T)。
二、基因轉移的受體細胞
研究轉基因動物的制備，首先要考慮用何種轉基因受體細胞。選擇合適的受體細胞和可行的基因導入途徑，是該技術成功的前提。基因轉移的受體細胞必須是全能細胞，全能細胞隨著細胞分化、胚胎發育，可以把其中的基因組貯存的全部遺傳信息擴大到生物體所有的細胞中。除此以外至少是多能細胞。滿足轉基因動物需要的受體細胞有以下幾種。
(一)原生殖細胞：禽類的原生殖細胞容易分離、培養和冷凍，所以，這種受體細胞在禽類動物較易實現。
(二)配子：配子能把自身攜帶的基因組全部信息和外源插入基因序列，完整地貢獻給合子。由于精子可用作有效的轉移載體，所以，可以精子作為目的基因的受體。較多的是用重組病毒直接感染精子，精子即可把外源基因傳到合子。
(三)受精卵或胚胎內細胞團：精卵結合形成的單細胞受精卵，是最常用的外源基因轉移的受體；受精后的早期胚胎及囊胚期稍后的胚胎含有的內細胞團，該細胞團內含有未分化的胚胎干細胞，也可認為是全能的，或至少是多能性的，所以，用該時期的內細胞團或囊胚期的細胞作為外源基因的受體細胞，也可望達到基因轉移的目的。但這種情況下制備的轉基因動物多為嵌合體。
三、實驗動物的準備
本文主要敘述制備轉基因鼠的實驗程序。
(一)不育雄性公鼠:結扎公鼠與母鼠交配以后產生假孕母鼠。受結扎的公鼠需8周以上，對種系無特殊要求。在正式實驗前，結扎公鼠需與性成熟的雌性小鼠交配，反復交配兩次或三次，經檢查雌體有陰道栓，但均不懷孕產仔，則證明結扎成功。結扎公鼠使母鼠產生陰道栓的能力可維持2年。值得注意的是，如結扎公鼠與母鼠交配4～6 次均不能產生陰道栓，則該公鼠必須更換。
(二)假孕雌性母鼠:作為獲得外源基因即轉基因胚胎的養母，要求6周齡至5 個月較合適，對種系無特殊要求。其生殖系統的生理狀態應與移進胚胎的發育階段同步化，從而為移植胚胎提供著床和繼續發育的生理條件。將選好的成年健康雌性個體與不育雄性個體進行交配，時間應與供體(取受精卵的雌體)同時進行。一般為下午4點鐘合籠,次日晨選有陰道栓的待用。
(三)取受精卵的雌性母鼠：如果無特殊遺傳背景的要求，一般用雜交F1受精卵較為理想。因雜交F1代胚胎的發育能力和對外環境的耐受能力都較強，有益于提高移植胚胎的出生率。在對遺傳背景有特殊要求的情況下，供卵母鼠需選擇種系，例如把一種鼠的等位基因轉移到另一種不同等位基因的種系，這種卵供體母鼠必須有特定的遺傳背景，因此需用純系鼠。在實際操作中，一般用4～6周母鼠作為超排卵供體，3～4周母鼠產卵更多但卵細胞膜脆性較大，在處理過程中易破裂，而6周以后母鼠產卵逐漸減少。
(四)與卵供體母鼠交配的正常公鼠：公鼠性成熟約在6～8周，不同種系有些區別。每個作超排卵的母鼠與一只公鼠交配，次日上午檢查是否有陰道栓并作記錄。如兩次以上都不能使母鼠有陰道栓，或總的陰道栓產生率低于60～80％，則需更換公鼠。
四、基因導入的方法
(一)顯微注射法：在顯微鏡下，可借助顯微操作儀，將毛細玻璃管直接插入受精卵的雄原核中(較大的原核),注入特定的外源基因,即為基因顯微注射法。下面把利用顯微注射法制備轉基因鼠的方法和步驟簡述如下。
1. 超數排卵(超排)與取卵
(1)超數排卵：在雌性動物發情周期的某一階段,用促性腺激素促使卵巢里大量卵泡成熟并排出，稱超數排卵。影響母鼠超排因素有母鼠的性成熟程度、營養、體重及母鼠種系。超排的最佳時間隨種系不同而異,一般在3～5周，超過6周超排卵數明顯減少。
在實際操作中常取4～6周齡的母鼠作超排卵供體，腹腔注射孕馬血清(PMS) 和人絨毛膜促性腺激素(hCG)誘導母鼠排卵。PMS模擬卵泡刺激素(FSH)作用，hCG模擬黃體生成素(LH)的作用。二者注射時間間隔為42～48h，排卵發生在注射hCG后10～13h,注射劑量為每鼠5～10u。為了實驗方便，常在下午注射PMS，隔日同一時間注射hCG，注射hCG 后每只母鼠置于一個單獨飼養的正常公鼠籠內，次日晨檢查陰道栓。
(2)取卵：用頸椎脫臼法處死有陰道栓的雌鼠，把完整的輸卵管帶一小段子宮剪下,置于PBS平衡鹽溶液中，在解剖鏡下找出輸卵管傘部，用帶4號針頭的注射器將受精卵沖出，立即將卵子換至新鮮培養液內洗滌3～4次即可用于顯微注射。
2. 注射外源DNA：顯微注射需用顯微操作儀，用來控制顯微持卵針和顯微注射針。持卵針是顯微注射時固定受精卵的細玻璃管，管口平滑，通過一注射器控制持卵針，使其吸住要進行注射的受精卵。用來注射外源DNA的細注射針管表面平滑，尖端鋒利,便于注射時穿過透明帶、細胞膜等。取已制備好的受精卵細胞和外源DNA懸液,在倒置顯微鏡下做顯微注射。注射時先用持卵針吸住受精卵，再用注射針吸取外源DNA懸液,然后推動注射針，使其刺入受精卵的雄原核，將DNA注入。注射完畢，慢慢抽出注射針,將受精卵放入新的培養液中，使其恢復。一般50～80％的受精卵在顯微注射后仍保持健康。
3. 注射后受精卵(或胚胎)的移植：注射后單細胞至桑椹胚的卵(受精后0.5天到3.5天)移植至受孕后的0.5天的假孕鼠的輸卵管，輸卵管移植需用被透明帶包裹的卵。也可將注射有外源DNA的受精卵或桑椹胚體外培養至囊胚，再行移植。顯微注射后3.5天的囊胚移植至受孕后2.5天的假孕鼠子宮，子宮移植不需要有透明帶。
此法的優點是，在一定設備和經驗條件下，實驗過程大為簡化；任何DNA 順序都可直接導入原核內,導入的外源DNA在卵裂前與受體基因組整合,其缺點在于導入的外源DNA通常以多拷貝串聯的形式隨機地整合于受體基因組中，妨礙其表達的正常調節。
(二)逆轉錄病毒感染法：以逆轉錄病毒作載體， 把重組的逆轉錄病毒載體DNA包裝成高滴度病毒顆粒，感染發育早期的胚胎，將外源基因導入宿主的染色體內的方法稱為逆轉錄病毒感染法。此法操作簡單，可通過注射將重組病毒轉移到囊胚腔內，也可將去透明帶的胚胎與分泌重組病毒顆粒的細胞共培養，以達到將外源DNA 轉移到胚胎中去的目的。
這一方法的優點是，重組逆轉錄病毒可同時感染大量胚胎。感染后的整合率高；外源DNA在受體細胞基因組中的整合通常是單拷貝的；不需要昂貴的顯微注射設備。本法的缺點是，由于選用的受體是早期胚胎，不是受精卵，致使外源DNA 在動物各種組織中的分布不均,不易整合到生殖細胞中；由于病毒衣殼大小有限,限制了被導入的外源 DNA的大小，一般不超過15Kb。
(三)胚胎干細胞介導法：囊胚的內細胞團含有未分化的胚胎干細胞。體外建株的胚胎干細胞稱為EK細胞(embryonic karyotype cell)或(embryonic stem cell)。 如果將EK細胞移植到正常發育的囊胚腔中，它們能很快地與受體的內細胞團聚集在一起，參與正常的胚胎發育。用重組的逆轉錄病毒作為載體感染EK 細胞， 再將此EK細胞移植入受體囊胚腔，可發育成攜帶著特定外源DNA的個體。
采用這一方法的優點是，外源DNA的整合率高； 整合在生殖細胞中的比例也很高。缺點是，EK細胞株不易建立，長期培養后出現細胞分化現象；生產的轉基因動物都是嵌合體。
(四)精子載體法 將外源DNA與精子一起孵育，精子可捕獲外源DNA，并通過受精過程將外源DNA導入受精卵。此法不僅可免去復雜而昂貴的設備， 且可省去不少繁雜的操作和條件準備。但該法有些結果不能重復。
此外，還有一些其它的方法，都有不同的優缺點。
五、轉基因鼠的檢測
待假孕母鼠產出幼仔后,可用幼鼠尾巴提取DNA;對于一些基因調控研究,需要盡快獲得信息而暫不需保留轉基因鼠，從胎鼠組織或幼鼠尾巴提取的DNA,可用PCR、Dot blot
(斑點雜交)、Southern blot(Southern轉移)等多種方法分析以確定是否轉基因鼠。
六、基因轉移后的存在方式及表達
(一)外源基因導入后的存在方式：外源基因被導入受體細胞后，在受體細胞內的存在方式有三種：
1. 非同源重組。大多數外源基因導入受體細胞后,與受體細胞染色體的某一位點隨機整合，這樣可帶來正常基因的插入、缺失、易位等突變。
2. 同源重組。導入的外源DNA與受體細胞染色體的DNA 通過順序取代或順序插入實現同源重組。通過同源重組有可能導致受體細胞正常的基因發生突變，當然，也有可能代替原來的有遺傳缺陷的遺傳基因，從而糾正遺傳缺陷。
3. 游離存在。外源基因沒有整合到受體細胞中,而是以附加體的形式游離在受體細胞內，能自我復制，并能100％的傳給下一代。
(二)外源基因導入后的表達：外源基因導入受體細胞后能否表達，是受許多因素影響的。
1. 外源基因本身的結構和性質。
2. 附帶的原核載體順序。研究發現，原核載體的存在對α-甲胎蛋白、β- 珠蛋白等基因的表達具有明顯的抑制作用，而對免疫球蛋白和膠原蛋白基因的抑制不明顯。
3. 染色體位置。 外源基因在受體動物細胞染色體上整合部位的基因環境對外源基因表達的影響很大。
4. 甲基化。被轉移的基因容易甲基化而失活。
外源基因在受體細胞中的表達方式表現為組織特異性和發育階段特異性。組織特異性表達是由于某些調節元件如啟動子和增強子的作用造成的。比如，免疫球蛋白基因只在B細胞中表達，原因是免疫球蛋白基因的啟動子只存在于B淋巴細胞內，這是一類只在專一細胞中表達的啟動子；另有一類可在多種組織細胞中表達的啟動子，比如，人生長激素基因分別在肝與腎、淋巴器官和肌肉中表達。發育階段特異性表達是指轉基因在個體發育中的表達具有嚴格的時空特性，受到精細的調控。