DNA分子的限制性內切酶消化

限制性內切酶可特異地結合于一段被稱為限制酶識別序列的DNA序列位點上并在此切割雙鏈DNA。絕大多數限制性內切酶識別長度為4、5或6個核苷酸且呈二重對稱的特異序列，切割位點相對于二重對稱軸的位置因酶而異。一些酶恰在對稱軸處同時切割DNA雙鏈而產生帶平端的DNA片段，另一些酶則在對稱軸兩側相對的位置上分別切斷兩條鏈，產生帶有單鏈突出端（即粘端）的DNA片段。1個單位限制性內切酶是指在最適條件下，在50μl體積1小時內完全切開1μgλ噬菌體DNA所需的酶量。不同的限制性內切酶生產廠家往往推薦使用截然不同的反應條件，甚至對同一種酶也如此。但是，幾乎所有的生產廠家都對其生產的酶制劑優化過反應條件，因此購買的內切酶說明書上均有其識別序列和切割位點，同時提供有酶切緩沖液（buffer，10×、5×）和最適條件，使得酶切反應變得日益簡單。
一、限制性內切酶對DNA消化的一般方案
1.限制性內切酶反應一般在滅菌的0.5ml離心管中進行。
2.20μl體積反應體系如下：
DNA 0.2-1 μg
10×酶切buffer 2.0 μl
限制性內切酶 1-2 u（單位）
加ddH2O 至 20 μl
限制性內切酶最后加入，輕輕混勻，稍加離心，放置于最適溫度水浴并按所需的時間溫育，一般為37℃水浴消化1hr。
3.用于回收酶切片段時，反應總體積可達50-200μl，各反應組分需相應增加。
4.多種酶消化時若緩沖液條件相同，可同時加入；否則，先做低溫或低鹽的酶消化，再做高溫或高鹽的酶消化。
5.酶切結束時，加入0.5M EDTA（pH 8.0）使終濃度達10mM，以終止反應。或將反應管在65℃水浴放置10min以滅活限制性內切酶活性。
6.如消化反應體積過大，電泳時加樣孔盛不下，可加以濃縮：終止反應后，加入0.6體積的5M乙酸銨（或1/10體積3M NaAc）和2倍體積無水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃離心12000g× 5min。傾去含大部分蛋白質的上清液。于室溫晾干DNA沉淀后溶于適量TE中（pH 7.6）。
7.如要純化消化后的DNA，可用等體積酚/氯仿（1∶1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。
二、電泳檢測
取質粒酶切產物適量，加適當loading buffer混勻上樣，以未經酶切的質粒或/和酶切的空載體（如有）作對照，采用 1-5V/cm的電壓，使DNA分子從負極向正極移動，至合適位置取出置紫外燈下檢測，攝片。
三、注意事項
1. 濃縮的限制性內切酶可在使用前以1×限制酶緩沖液稀釋，切勿用水稀釋以免酶變性。
2. 購買的限制性內切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是穩定的。進行酶切消化時，將除酶以外的所有反應成分加入后即混勻，再從-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶時都應更換一個無菌吸頭，以免酶被污染。加酶的操作盡可能快，用完后立即將酶放回-20℃冰箱。
3.盡量減少反應體積，但要確保酶體積不超過反應總體積的10%，否則酶活性將受到甘油的抑制。
4.通常延長時間可使所需的酶量減少，在切割大量DNA時可用。在消化過程中可取少量反應液進行微量凝膠電泳以檢測消化進程。
5.注意星號酶切活力。