一． 污染的預防
進行PCR操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規程，最大程度地降低可能出現的PCR污染或杜絕污染的出現。
（一）劃分操作區：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區域內進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區內進行：
1. 標本處理區，包括擴增摸板的制備；
2. PCR擴增區，包括反應液的配制和PCR擴增；
3. 產物分析區，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。
各工作區要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR擴增→產物分析→產物處理。
切記：產物分析區的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。
（二）分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA：
1． PCR用水應為高壓的雙蒸水；
2． 引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區配制；
3． 引物和dNTP應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發生污染時查找原因。
(三) 實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：
1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；
2. 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；
3. 避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度；
5. 最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管；
6. 操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性；
7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區；
8. 重復實驗，驗證結果，慎下結論。
二． 追蹤污染源
如果不慎發生污染情況，應從下面幾條出發，逐一分析，排除污染。
（一）設立陰陽性對照：有利于監測反應體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應選擇擴增弱，且重復性好的樣品，因強陽性對照可產生大量不必要的擴增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質粒為對照，100個拷貝之內的靶序列就足以產生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為PCR敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點雜交等）檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應包括PCR體系中各試劑的時機對照，即包括PCR反應所需的全部成分，而不加模板DNA，這對監測試劑中PCR產物殘留污染是非常有益的。如果擴增結果中試劑對照為陽性結果，就是某一種或數種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設立不同的反應管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應馬上處理。
（二）環境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發現試劑被污染了，如果預防措施比較嚴密，則考慮可能為環境污染。
環境污染中常見的污染源主要有：
1. 模板提取時真空抽干裝置；
2. 凝膠電泳加樣器；
3. 電泳裝置；
4. 紫外分析儀；
5. 切膠用刀或手術刀片；
6. 離心機；
7. 冰箱門把手，冷凍架，門把手或實驗臺面等；
此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源。1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2）0.1ml去離子水浸泡；3）取5ml做PCR實驗；4）電泳檢測結果。
8. 氣溶膠。如果經過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR產物的氣溶膠造成的，此時就應該更換實驗場所，若條件不允許，則重新設計新的引物（與原引物無相關性）。
三．污染處理
（一）環境污染
1. 稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤；
2. 紫外照射（UV）法：紫外波長（nm）一般選擇254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產物污染時，要考慮PCR產物的長度與產物序列中堿基的分布，UV照射僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大。UV照射時，PCR產物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰核苷酸的序列。在受照射的長DNA鏈上，形成二聚體缺陷的數量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環丁烷型嘧啶復合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA鏈間與鏈內的交聯和DNA斷裂等）均可終止Taq DNA聚合酶的延伸。這些位點的數量與二聚體位點相當。如果這些位點（0.13/堿基）在DNA分子上隨機分布，一個500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點，那么，105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反，如果100bp的片段，每條鏈上僅有6處損傷，105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長度限制的原因。
（二）反應液污染
可采用下列方法之一處理：
1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室溫反應30 min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進行正常PCR擴增。該方法的優點是不需要知道污染DNA的序列；
2. 內切酶法：選擇識別4個堿基的內切酶（如Msp I和Taq I等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進行PCR；
3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進行紫外照射，注意事項與方法同上述UV照射法；
4. g射線輻射法：1.5kGy的輻射可完全破壞0.1ng基因組DNA，2.0 kGy可破壞104拷貝的質粒分子，4.0 kGy仍不影響PCR，但高于此限度會使PCR擴增效率下降。引物可受照射而不影響PCR，g射線是通過水的離子化產生自由基來破壞DNA的。
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR擴增片段通常為300bp左右，因此UNG的預防作用日益受到重視和肯定。
1. 原理：在PCR產物或引物中用dU 代替dT。這種dU化的PCR產物與UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG對不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。
2. dUTP法：用dUTP代替dTTP，使產物中摻入大量dU。在再次進行PCR擴增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產物的殘留污染。由于UNG在PCR循環中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU的新的PCR產物。
3. dU引物法：合成引物時以dU 代dT，這樣PCR產物中僅5ˊ端帶dU。UNG處理后，引物失去了結合位點而不能擴增。對長片段（1-2kb以上）的擴增用dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點。dU引物最好將dU設計在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。
4. 優點：可以去除任何來源的污染；UNG處理可以和PCR擴增在同一個反應管內進行；由于擴增產物中有大量dU存在，可徹底消除污染源。
5. 需注意的是摻入dUTP的DNA不應對產物的任何操作有影響，在進行PCR產物克隆時，應該轉化UNG-（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉化產物會被受體菌UNG消化掉。
（四） 固相捕獲法
用于去除標本中污染的核酸和雜質，原理如下：1）用一生物素標記的單鏈RNA探針與待擴核酸雜交，雜交區域是非擴增區；2）用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸，通過漂洗可去除污染的擴增產物和雜質；3）洗脫靶分子后用特異引物擴增非RNA探針雜交區域。第2）步的漂洗后可用PCR檢測以確定標本是否被擴增產物或重組質粒污染。
（五）RS-PCR法（RNA-specific PCR）
也稱為鏈特異性PCR，主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。其關鍵在于設計引物，逆轉錄引物的3ˊ端（A區）有2 0個核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端2 0個核苷酸（C區）為附加修飾堿基。與mRNA逆轉錄后，經超速離心使 cDNA與多余引物分開，再用和第二引物（C）以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，以后的PCR循環中用逆轉錄引物的B區和引物C進行擴增加尾cDNA，而污染的DNA或質粒DNA才不會被擴增。
（六）抗污染引物法
該對引物擴增時通過病毒DNA克隆如入質粒的位點。這一區域只存在完整的原病毒中，在重組質粒中，這一區域分成兩個區域與克隆位點被。如果重組質粒污染了標本，也不能擴增出任何條帶，即使出現了擴增帶，其大小也與預期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴增，因此只要出現預期大小的擴增帶就可以證明標本是陽性的，該法試用于環狀靶分子系列。
四．其它PCR檢測方法：
（一） 兩步法：是指在用套式PCR方法擴增某些含量低微的標本時，兩對引物在同一個管中以簡化步驟，減少污染。通常第一步進行20-25個循環，擴增外引物片段；第二步再進行10個循環，擴增內引物片段。兩步法對內外引物的Tm值有特殊要求，即內外引物的退火溫度高（如68℃），在此溫度下內引物不與模板退火，然后降低退火溫度（至55℃）再擴增內引物片段，這樣，在操作過程中，僅打開PCR反應管一次，大大減少了污染的可能性。
（二） 熒光法：亦稱熒光PCR技術（fluoresence PCR, F-PCR），是1995年由美國PE公司首先研制成功的，它融匯了PCR的靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術精確定量的優點，電腦同步跟蹤，數據自動化處理，直接探測PCR過程中的變化以獲得定量的結果，不需要做PCR后處理或檢測，完全閉管操作。探針標記除用TET和FAM外，還可用HEX、JOE作為報告熒光，3′端的淬滅基團常用TAMRA。在探針保持完整時，熒光報告基團的熒光被熒光抑制基團淬滅，而在探針被切斷后，熒光報告基團才發出報告熒光，且熒光的強度與PCR產物的數量呈正比。熒光檢測儀器透過PCR管壁能直接檢測到熒光信號的波長和長度變化。
主要有以下優點：
1.探針特異性強，假陽性率低；
2.操作快速，不需要PCR后處理；
3.定量范圍寬，HBV 0.4fg-4000fg/ml(102-106 Dane′s particle/ml)；
4.閉管操作，PCR產物污染少；
5.靈敏度高。
主要方法有：
1..熒光探針法：進行熒光PCR檢測時，要求熒光探針必須完全與靶基因互補，長度以20-30個堿基為宜，必要時3′端磷酸化封閉，以防在擴增時作為引物延伸。該方法利用Taq酶的3′→5′聚合酶活性及5′→3′外切酶活性，可以在鏈延伸過程中實現鏈替換，并將被替換的探針切斷，故可進行定性與定量檢測。
熒光探針5′端標記的TAMRA，在480nm激發下產生530nm的紅色熒光；3′端標記的FAM，激發后產生綠色熒光。PE公司推出的TaqMan系統，即采用雙熒光探針，如配合使用PCR擴增與熒光檢測合二為一的儀器，可進行實時（real-time）定量檢測。
2．分子信標法：分子信標（molecular beacon）是一個發夾樣結構的特異探針，其環狀部分與靶序列互補。在室溫時，分子信標的發夾緊閉，熒光淬滅。PCR擴增時，隨著溫度升高，發夾松開，與單鏈模板特異結合，發出熒光。熒光強度與模板呈正比，故可用于PCR產物的定性及定量。
