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    mRNA差別顯示技術(DDRT-PCR)

    放大字體  縮小字體 發布日期:2006-07-01

    隨著PCR技術的發展,人們在此基礎上建立起了一系列基于基因分離的新技術新方法。如mRNA差別顯示技術(DDRT-PCR)、以及進一步改進的代表性差示分析(RAD),抑制性扣除雜交(SSH)和交互扣除RNA差別顯示技術(RSDD)。
    差別顯示PCR是根據絕大多數真核細胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾(polyA)結構,因此可用含oligo(dT)的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉錄成cDNA。該方法的創始人Liang P和Pardee A根據Poly A序列起點前2個堿基除AA外只有12種可能性的特征,設計合成了12種下游引物,稱3′-錨定引物,其通式為5’-T11MN;同時為擴增出polyA上游500bp以內所有可能性的mRNA序列,在5′端又設計了20種10bp長的隨機引物。這樣構成的引物對進行PCR擴增能產生出20000條左右的DNA條帶,其中每一條都代表一種特定mRNA種,這一數字大體涵蓋了在一定發育階段某種細胞類型中所表達的全部mRNA。
    差別顯示技術自1992年建立后,一直在不斷進行著改進。如在1994年,Ito等對3′端錨定引物的設計由固定兩個堿基變為一個堿基固定的引物,這就使原來12種引物減至3種即可(5′T12G,5′T12A,5′T12C),這樣做減少了每個mRNA樣品對逆轉錄反應種類的需要,并且把由于簡并性引起的某些RNA的代表性差和RNA數量過多現象降低到最低程度;在隨后的兩年中,研究人員有在3′端引物和5′隨機引物末端分別加上了限制性內切酶識別位點(如Hind III酶切位點),使得5′端引物條數改為8條,長度為13bp,而3′端引物則由18個堿基組成。這樣形成的24種引物對,經計算機同源性分析表明同樣能覆蓋全部mRNA,使實驗簡化,同時由于引物變長,使cDNA擴增更為有效。有的實驗室采用把Bakman公司的kit,其引物5′端為26bp,3′端為31bp,并加上了T3和T7兩端的測序引物,由儀器切割差異條帶后,再次擴增,并通過熒光標記,用計算機統計出結果。此外,許多學者針對該技術在****作中假陽性高等問題,還從設計對照、提取胞質RNA、更換放射性標記物以及改變PCR反應條件等等方面提出了相應解決方案,以求這一技術得到進一步完善。

    DD-PCR與示差篩選、扣除雜交相比,具有很多優點:
    1)速度快,較易操作;
    2)由于PCR擴增技術的應用,使得低豐度mRNA的鑒定成為可能,且靈敏度高;
    3)可同時比較兩種以上不同來源的mRNA樣品間基因表達的差異。
    盡管差別顯示技術有以上諸多方面的優點,但在實際操作中仍存在一些問題,主要表現在:
    1)出現差別條帶太多,假陽性率高達70%左右,重復性差,且對高拷貝數的mRNA具很強的傾向性;
    2)擴增條帶分子長度較短,一般在110~450bp之間。

     

     

     
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