反相色譜( RPC)是高效液相色譜HPLC最受歡迎的一個應用,尤其對蛋白的表征非常有用。因為樣品的洗脫與其增水性有很大關系,一般不可能在洗脫時間(體積)的基礎上識別被分離的樣品。通常,每一洗脫片段都必須用其它技術進行進一步的分離和分析,才能得到蛋白質分子的分子行為表征。
在 HPLC系統的基礎上,加上一臺miniDAWN或DAWN檢測器,會大大簡化蛋白的表征,可以直接測絕對分子量并可觀察溶液中的蛋白特性。
圖 1是輕度氧化的基本纖維原細胞增長因子(bFGF)(由0.2當量的DTNB制成)的色譜圖。前兩個峰的光散射信號大約是UV信號的兩倍,而第三個峰兩者的信號強度相等。從圖上很清楚地看出,從左到右三個峰,其中兩個是兩種二聚體,一個是單體bFGF,它們的分子量分別是33K,34K,17K道爾頓。
圖 2是四個不同組分的分子量對洗脫體積圖,每一組分都有不同程度的氧化。很明顯,存在著二聚體、三聚體、四聚體,但出現的順序和洗脫體積的順序不一致。
采用的系統是 HPLC,包括HP 1050四元泵、脫氣機、自動進樣器,UV二極管陣列檢測器和一臺miniDAWN。一根Vydac C4蛋白柱。(150mm×4.6mm,300埃),流速0.7ml/min.
miniDAWN可對每個洗脫峰進行絕對表征,另外,還可測得每一洗脫片段的均方根旋轉半徑。例如:對bFGF五聚體,其旋轉半徑大約為13納米,表明分子量85K道爾頓的多聚體是棒狀結構的構型。
只要在反相色譜 RPC上加一臺miniDAWN就可對每一洗脫片段測量絕對分子量、多聚體的形狀、分子尺寸 、分子構型。