數字PCR無疑是PCR領域最激動人心的創新之一,這一技術的誕生讓許多人定量的夢想成為現實。定量PCR和數字PCR都能實現對樣品中的核酸進行定量,它們之間的差別在于定量PCR依賴于標準曲線和參照基因,而數字PCR則能計數DNA分子進行定量。在許多領域的研究中數字PCR都是難以取代的寶貴技術,包括檢測罕見等位基因、在野生型背景下鑒定突變基因、區別低水平的拷貝數變異、驗證二代測序結果和基因表達分析等。
數字PCR的基本工作原理很簡單,先將樣品劃分為多個PCR反應,每個反應最多只含有一個目標分子,然后用熒光標記的探針進行檢測,計數含有目標分子的反應。正因如此,數字PCR不需要標準曲線,就可以真正實現對樣品的定量。不過,這并不意味著dPCR就永遠是的選擇。“盡管數字PCR能夠定量,其工作流程也比傳統qPCR簡單得多,但數字PCR的通量比較低,”Fluidigm公司的分子生物學主管Ramesh Ramakrishnan說。“總的來說,傳統qPCR通量更高,而數字PCR的靈敏度和性更好。在尋找罕見突變時數字PCR尤其適用。”
二、分液帶來的高精度
樣品分液(Partitioning)是決定數字PCR性的最重要因素之一。數字PCR通過分液將樣品分成小份,通常每一份最多只含有一個拷貝的目標核酸。熒光標記的探針可以用來揭示目標核酸存在與否,并由此獲得初始樣品中的分子數。“數字PCR這種方法非常簡單,一個陽性信號代表著一個目標分子,而沒有信號就意味著目標不存在。”Ramakrishnan說。
Life Technologies公司的TaqMan® OpenArray® 數字PCR試劑盒可以在OpenArray® 平板上運行,OpenArray® 平板是一種不銹鋼的微流體平板,只有顯微鏡載玻片大小。這種平板的表面刻有3,072個通孔,每一個通孔都是一個獨立的PCR反應孔。每塊平板上的通孔排列形成48個子陣列,每個子陣列含64個通孔。OpenArray® 平板的外表面由疏水包被,而通孔內部是親水包被,由此分隔各通孔中的樣品,使其無法彼此接觸和混合。
OpenArray® 平板可以在Life Technologies的OpenArray® 實時定量PCR系統和QuantStudio™ 12K Flex 上使用。QuantStudio™ 12K Flex dPCR儀能支持96孔或384孔板、TaqMan® Array卡片和中等密度的OpenArray平板。“QuantStudio™ 12K Flex dPCR儀能夠同時運行四個OpenArray平板,一次性生成12,228個單獨的PCR循環,并且實時收集PCR擴增的數據,”Life Technologies公司的qPCR資深產品Iain Russell說。“OpenArray數字PCR平板的開放性,使研究者們可以根據自身需要,對反應的重復數進行調整,在通量、性能和實驗成本之間達到平衡。你可以每種樣品只使用一個子陣列,這樣運行一次就可以得到192個數字PCR結論。或者你也可以一種樣品運行四個平板(192個子陣列),使系統性能和可重復性最大化。”
Fluidigm和Life Technologies采用微流體芯片和微流體通道進行數字PCR。與此不同的是,Bio-Rad選擇將樣品分為微小的液滴,RainDance Technologies隨后也加入了這一行列。“我們的*優勢在于,可以將樣品分為1納升液滴,這些液滴的一致性和可重復性都非常好。通過這一技術,我們可以將每個樣品分為20,000個液滴,” Kurtz說。其他系統的分液數量大多在760到3,000之間,“分液數量越多可以使分析更為。”由于分液更多,在Bio-Rad的系統中每個液滴能容納多至五個目標,大大提高了檢測的動態范圍。“我們的系統可以解析1至100,000個目標拷貝,因此不需要在運行數字PCR之前對樣品進行系列稀釋,”Kurtz補充道。