植物基因組DNA提取試劑盒-MagExtractor®-Plant Genome-

使用說明書
 （Code No.：NPK- 500）
  TOYOBO CO., LTD. Biochemical Operations Department
OSAKAJAPAN

—目錄—
目錄                                                                                            頁數
 1．前言.......................................................................................................................... 1
2．使用前須知.............................................................................................................. 1
3．試劑盒中所包含的物品.......................................................................................... 2
4．操作程序.................................................................................................................. 2
     1］試劑盒以外所需要的其他物品...................................................................... 2
         （1）試劑............................................................................................................. 2
         （2）器具及器材................................................................................................. 3
     2］抽提流程.......................................................................................................... 3
     3］樣品前處理...................................................................................................... 4
     4］使用MFX-2000進行Plant DNA抽提......................................................... 4
         （1）操作程序的選擇......................................................................................... 4
         （2）加溫block以及回收block溫度的設定.................................................. 4
         （3）附帶專用過濾器的tip安裝....................................................................... 5
         （4）專用試管的安裝......................................................................................... 5
         （5）試劑的安裝................................................................................................. 6
         （6）樣品的安裝................................................................................................. 8
         （7）抽提開始..................................................................................................... 8
         （8）樣品的回收................................................................................................. 8
     5］使用手工方法進行Plant DNA抽提............................................................. 8
5．一般樣品的分析...................................................................................................... 9
     1］DNA定量測定................................................................................................ 9
     2］電泳............................................................................................................... 10
     3］PCR............................................................................................................... 10
6．抽提實例................................................................................................................ 10
7．疑難解答................................................................................................................ 11
 
注意事項
 
本試劑盒中所包含的所有試劑屬研究用試劑。請不要用于診斷或臨床等場合。在使用本試劑盒的時候，請嚴格遵守常用的實驗室安全操作程序。
Hoffman-La Roche Ltd.擁有PCR方法的專利權。

1．前言
MagExtractor-Plant Genome-利用在Chaotrpic（鹽）的情況下，DNA吸附于硅膠表面的特性，進行plant DNA的抽提。本試劑盒與自動核酸抽提裝置MFX-2000并用，可簡便地從植物葉及植物培養細胞等植物樣品中抽提出高純度的plant DNA。另外，本試劑盒也可用作手動抽提用試劑盒而加以使用。
 
特征
·本試劑盒用于從植物標本如培養細胞和葉子以及其它植物組織中進行DNA抽提。
·無需進行乙醇沉淀，可以實現快速抽提。
·不使用苯酚。
·不使用RNase。
·所抽提的DNA被回收到TE緩沖液中，可以被直接用于PCR或者其它分析方法。
 
2．使用前須知
·MagExtractor-Plant Genome-適用于以下樣品：

對應樣品	樣品量	主要用途
植物標本，如葉子以及培養細胞	0.01到0.1g	PCR

參見第十頁“6. 抽提實例”。
 
·有關溶解液的儲存
由于本試劑盒是在低溫下進行儲存以及運輸，因此溶劑中的表面活性劑成分將有所沉淀。按照以下的步驟，請在室溫（20~30℃）下進行相應的溶解以及儲存。從溶劑的表面上看，有些情況下可能沒有任何沉淀出現，但是，可能已形成了透明凝塊，故在使用之前，務必進行以下操作。同樣，如果在儲存期間產生沉淀，也進行相同的操作并進行溶解。其它試劑請在4℃下進行儲存。
（參照第2頁“[3] 試劑盒中包含的物品”。）
 
（1）在50℃的水浴下，加熱10分鐘。
（2）輕輕地上下轉動瓶子以溶解沉淀的凝塊。（劇烈搖動會形成泡沫。）
（3）在50℃的水浴下中，再次加熱5分鐘。
（4）輕輕地上下轉動瓶子以進行完全溶解。
如果在溶液中仍然有一些未溶解的部分，則在水浴下中再次加熱5分鐘并上下轉動混合直到未溶解的部分完全被溶解。
（可能會形成透明凝塊，請進行兩次檢查以確保完全溶解。）
 
·建議在室溫（20~30℃）下使用本試劑盒。低溫會導致溶劑成分的沉淀可能會影響
本試劑盒的性能。

3．試劑盒中所包含的物品
在本試劑盒中含有可以抽提出100份RNA樣品的試劑。請在以下的溫度下儲存這些試劑：

試劑	容量	儲存
溶解液	40ml	溶解后，在室溫（20~30℃）下保存。
吸附液	90ml	4℃
洗凈液	200ml	4℃
磁珠	5ml	4℃

·吸附液以及洗凈液含有高濃度的蛋白質變性劑。在處理時應小心謹慎并戴上手套以及其它防護用具并且實施適當的安全預防措施。萬一試劑沾在手或者皮膚上，請用清水充分清洗。如若碰到眼睛，請立刻用清水清洗，然后去看醫生。

 

4．操作程序
1］試劑盒需要的其他物品
（1）試劑
·液氮
·氯仿/異戊醇
將氯仿：異戊醇*1以比例24：1（體積比）混合
·滅菌水
市場上銷售的純水或者經過高溫高壓蒸汽滅菌消毒處理過的milli Q水。
·乙醇
99.5％以上的特級品。用于手動抽提時，請使用70％的乙醇。
·TE緩沖液（pH 8.0）
10mM Tris-HCI（pH 8.0），lmM EDTA（pH 8.0）
 
*1又被稱為3-甲基-1-丁醇。

 
（2）器具及器材
·微量移液器
·微量移液器用tip
·（具有大約3,000到12,000 rpm的）臺式離心機
·加溫block（也可以是水浴槽，65℃）
·1.5ml微型試管
 
當使用MFX-2000時：
·抽提專用試管（Code No.：MFX-301）.......................................... 用于樣品回收
·抽提專用6連試管（Code No.：MFX-302）................................... 用于進行抽提
·附帶專用過濾器的tip（Code No.：MFX-402）
·安裝試劑用試管（50ml、15ml、2ml）*1

 

 

2］抽提流程
經簡單的前處理之后，MagExtractor -Plant Genome-可以使用MFX-2000進行自動抽提。以下是關于抽提流程的說明。

 

 

 

 3］樣品前處理
進行DNA抽提時使用MagExtractor-Plant Genome-試劑盒進行DNA抽提時要求對所使用的樣品進行前處理。（參照第三頁上的“[4] –[2]抽提流程”。）
根據以下步驟，進行前處理。
 
（1）將儲存在液氮中的0.01~0.1g的樣品磨碎。（快速進行該項，并同時補充液氮以避免樣品融解。）
（2）將樣品移入1.5ml試管中。（使用液氮或者其它方法對使用的藥匙及試管進行提前冷卻以避免已磨碎的樣品被融解。）
（3）在樣品中添加300μl的溶解液并進行充分混合。（確認其沒有沉淀后再進行添加。如果有沉淀，請參照第一頁“2. 使用前須知”并對沉淀進行溶解。）
（4）使用旋渦混合器，劇烈振動10秒鐘。（只有將樣品完全浸沒溶劑之后，才能進行振動。）
（5）在65℃下培育10分鐘。（使用旋渦混合器，每隔3到4分鐘進行共2次的劇烈攪拌，每次5秒鐘。）
（6）添加300μl的氯仿/異戊醇。
（7）劇烈混合3~5秒鐘。（旋渦混合器可能無法使溶液被完全均勻地混合，可用手劇烈搖動使其混合。）
（8）用離心機以12,000 rpm的速度進行1分鐘的離心。（根據樣品的不同情況，可能會有少量的沉淀。如果發生了這種情況，請再用離心機進行2~3分鐘的離心。）
（9）將250μl的上清液回收到一個未使用過的1.5ml試管中。（如果上清液少于250μl，則必須非常仔細地進行操作，同時對溶液界面進行抽吸以回收上清液。上清液的量因樣品而有所不同。
例：         0.1g的煙草大約有250μl
                                                    0.1g的水稻植物大約有200μl
（10）添加600μl的吸附液。
（如果上清液少于100μl，則添加750μl吸附液。）

 4］使用MFX-2000進行Plant DNA抽提
在使用MFX-2000之前，請務必通讀完其使用說明書。
（1）操作程序的選擇
現在可供使用的MFX-2000程序可針對DNA、Total RNA、質粒DNA等的抽提。使用MagExtractor-Plant Genome-請用第13號操作程序。
 
（2）加溫block以及回收block溫度的設定
將加溫block以及冷卻 block設定成如下所述的溫度：
  加溫block 冷卻 block
溫度設定 OFF 10℃

·由于不使用加溫 block，請切斷其電源。
·使用簡易保冷block時，請將block事先置于冷藏庫或是低溫室進行予冷。簡易保冷可用于回收液的臨時保冷。

（3）附帶專用過濾器的tip安裝
將具有專用過濾器的tip安裝在tip架上。相關數量，請參見以下表格。
·請務必使用附帶專用過濾器的tip（Code No.：MFX-402）。
·tip已經過γ射線消毒。在進行安裝時，一定要使用手套。
·安裝超過規定數量的tip不會引起任何問題。
·將必要量的tip從左下方開始，垂直地排列在tip架上。有關安裝位置的更多細節，請參見MFX-2000使用說明書。

 

樣品數	tip數	樣品數	tip數
1	6	13	39
2	8	14	41
3	10	15	43
4	12	16	45
5	17	17	50
6	19	18	52
7	21	19	54
8	23	20	56
9	28	21	61
10	30	22	63
11	32	23	65
12	34	24	67

 （4）專用試管的安裝
根據樣品個數，將專用試管（編號.：MFX-301）或者特制的6連試管（編號：MFX-302）安裝在抽提架的A到F的插槽以及回收block上。
·除了以上提及的專用試管，不得將其它試管安裝在抽提架中，否則容易產生故障。
·專用試管（編號：MFX-301）以及帶螺旋帽的1.5ml試管*1被設置在回收block中。
·有關設置位置的更多細節，請參照MFX-2100使用說明書。
 
*Assist試管（編號：72.692）等

 
（5）試劑的安裝
將試劑注入到規定的試管中并將它們安裝在指定的試劑架上。
·確認每種試劑是否都已回復到室溫。
·試劑的必需量依據樣品的數量而定。請參照下頁的表格，安裝試劑。
·在進行分裝之前，請充分地攪動磁珠并進行確認，直到這些磁珠已均勻混合。然后將它們分裝到2ml試管中。另外，在注入磁珠后，請立刻（10分鐘之內）啟動儀器，否則會導致產物有很大的差異并有可能導致儀器發生故障。
·使用微量移液器分裝磁珠。對于其它試劑，則將試管上的刻度標記作為分裝時的標準。
·抽提后所剩的試劑可以被再次使用。但是，如果長時間存放不用，則由于蒸發或者其它現象液體成分可能會發生變化。請務必注意。
·請注意本試劑盒并不包含滅菌水、乙醇（99.5％以上的特級品）以及TE緩沖液（pH8.0）。（參照第2頁上的“4 - [1] - (1)試劑”。）

安裝位置	試劑名	試管容量
1	滅菌水	50ml
2	洗凈液	50ml
5	乙醇	50ml
7	磁珠	2ml
9	TE緩沖液（pH8.0）	15ml

 

每種試劑的使用劑量
 

試劑	滅菌水	洗凈液	乙醇	磁珠	TE
試管容量	50ml	50ml	50ml	2ml	15ml
安裝位置	1	2	5	7	9

樣品數	1	5 (20)	5 (20)	5 (20)	0.5 (1.5)	2 (5)
	2
	3		10 (20)	10 (20)
	4
	5		15 (20)		0.8 (1.5)
	6	10 (20)		15 (20)		3 (5)
	7
	8		20 (20)
	9
	10			20 (20)
	11		25 (35)
	12
	13				1 (1.5)
	14		30 (35)	25 (35)
	15
	16	15 (20)	35 (35)			4 (5)
	17
	18			30 (35)	1.3 (1.5)
	19		40 (45)
	20
	21
	22		45 (45)	35 (45)
	23				1.5 (1.5)
	24

 

 

 （6）樣品的安裝
按照第4頁上的“4 – [3] 樣品前處理”來制備樣品，并把它們安裝在抽提架上。
·如果使用帶有螺旋帽的1.5ml樣品試管，則剪掉蓋子連結部后將它們放在樣品的安裝位置上。
·將它們按照順序安裝在編號1～24的插孔中。
 
（7）抽提開始
按照以下標準，開始進行抽提。
①確認是否按照所規定的說明安裝了樣品、試管、專用試管（抽提架以及回收block）以及專用tip。
②確認每個架子的安裝位置以及工作臺是否已完全收納到里面（直至聽到“咔喳”聲）。關上機器前門。（如果機器前門未完全關上，則抽提不會開始。）
③接通MFX-2000的電源。
④在液晶顯示屏上將出現“操作程序”以及“樣品數”。輸入操作程序“13”并且在“樣品數”中輸入樣品數量的數值。
⑤屏幕上會顯示提示“請按下啟動鍵”，后按下“START”。
⑥抽提啟動后液晶顯示屏上會顯示“操作中”。
 
（8）樣品的回收
在完成抽提后，打開機器前門并取出樣品。
·在完成抽提后，所抽提的DNA將回收到安裝在回收block上的試管中。在液晶顯示屏上也將再次出現“請按下啟動鍵”。
·在已經證實了儀器已完全停止運轉之后，從回收block中取出試管并在冷藏或者在低溫（4~10℃）下儲存直到再次使用這些試管。
·從磁珠中溶出的DNA，由于使用的是大約100μl的溶出液（TE緩沖液），因此回收液也為100μl左右。

 

5］使用手動法進行Plant DNA抽提
本試劑盒也可以用于手工DNA抽提。可按照以下步驟進行抽提。
·對于磁珠分離，建議使用市場上銷售的1.5ml微型試管用磁性臺架。另外，使用臺式離心機以3,000 rpm 程度離心15秒鐘也能夠進行分離。
·未包含在本試劑盒中的其它必需物品
請參照第2頁“4 – [1] – (1)試劑”。
請事先制備將特級乙醇與滅菌水按7：3比例混合的70％乙醇溶液。（每個樣品需要大約2ml。）
 

 
①取出按照第4頁“4 – [3] 樣品前處理”制備的樣品。
②添加40μl磁珠。（在使用之前請將磁珠進行充分的混合。）
③使用試管混合器來進行1分鐘的劇烈混合。［DNA的吸收］
④將試管安裝在磁性臺架上并放置30秒左右以使磁珠凝集。（此時，對這些磁珠進行數次顛倒混合并且盡可能多地回收粘在蓋子上的磁珠。）
⑤去除上清液。
⑥添加900μl洗凈液。
⑦使用旋渦混合器劇烈混合5秒鐘。（此時，確認磁珠是否已被充分地分散以及混合。）
⑧將試管安裝在磁性臺架上并放置30秒左右以使磁珠凝集。（此時，對這些磁珠進行數次顛倒混合并且盡可能多地回收粘在蓋子上的磁珠。）
⑨去除上層清液。
⑩重復步驟⑥~⑨。
⑾添加900μl的70％乙醇溶液。
⑿使用旋渦混合器劇烈混合5秒鐘。（此時，確認磁珠是否已被充分地分散以及混合。）
⒀將試管安裝在磁性臺架上并放置30秒左右以使磁珠凝集。（此時，對這些磁珠進行數次混合并且盡可能多地回收粘在蓋子上的磁珠。）
⒁去除上清液。
⒂重復步驟⑾~⒁。（盡可能多地去除包括乙醇在內的任何殘留在蓋子上的物質。）
⒃添加100μl TE緩沖液。
⒄使用試管混合器劇烈混合1分鐘。［DNA的溶出］
⒅將試管安裝在磁性臺架上并放置30秒左右以使磁珠凝集。
⒆將含有DNA的上清液回收到一個未用過的1.5ml微型試管中。

 

5．一般樣品的分析
請按照以下注意事項進行操作。
1］DNA定量
·當用吸收度檢測法進行DNA定量測定時，請務必用離心機分離所回收的溶液（12,000 rpm， 1分鐘）并使用上清液。
·當計算A260nm/A280nm比例以及DNA濃度時，請務必用A320nm數值進行校正。

DNA濃度	(A260-A320) x 50μg/ml
A260nm/A280nm	(A260-A320) /(A280-A320)

 

 2］電泳
·若將一部分回收液直接用于電泳，請將Loading Dye的量增加為通常的1.5到2倍，否則可能會發生樣品無法沉入樣品孔中，使得電泳失效。
 3］PCR
·回收液中混有大約10％的乙醇溶液。如果直接用于PCR，可能會阻礙反應的進行。因此，不要超過反應總液的五分之一（即：在每50μl的反應液中最多可有10μl）。
·可能會在所回收的溶液中混入了少量的磁珠。但這并不會阻礙PCR。

6．抽提實例
以下是使用MFX-2000從0.1g樣品中進行抽提的實例。

樣品	回收量
煙草（葉子）	3~5μg
煙草（培養細胞）	2~3μg
水稻植物（葉子）	3~5μg
Arabidopsis thaliana（葉子）	1μg
番茄（葉子）	3μg
卷心菜（葉子）	3μg
玉米（葉子）	3~4μg

 

 

原因	對策
樣品過剩	即使使用規定量以上的樣品，也不會使回收量上升，反而會使效率下降。請減少樣品量。另外，有的樣品單位重量下體積可能會很大。如果無法浸沒在溶解液中，則也請減少樣品量。
破碎不充分	液氮下的凍結粉碎不充分是一個原因。進行充分的破碎處理直到它成為細粉末。并請注意破碎時不要使樣品解凍。
溶解不充分 （1）氯仿抽提液為250μl左右的情況   （2）氯仿抽提液低于150μl或者非常少的情況	可能是溶解液與樣品之間混合不充分，或者樣品本身難以溶解所致。將溶解液與樣品進行充分混合，使用旋渦混合器振動1分鐘后再進行抽提。（通常為10秒鐘） 可能是樣品內水份含量較少而吸收了部分溶解液。請添加溶解液至350~400μl并按照以上（1）的對策繼續進行抽提，即可獲得良好效果。
試劑量不足 （MFX抽提）	確認試劑量是否不足或者檢查殘留物的數量。如果幾乎沒有任何殘留物（200μl以下），說明試劑量不足。
吸附，溶出不充分 （手動抽提）	使用手動法時，通過使用試管混合器攪動1分鐘來使磁珠吸收DNA以及從磁珠中分離出DNA。（參照第9頁“5 - [5] 手動抽提法”(3)，(17)）。各攪拌10分鐘左右，則DNA回收量將會增加。