手機版
微生物及無菌知識培訓
一、前言
我們所生活的環境中，到處都存在著大量的微生物。在一般空氣中，微生物達800~ 3500個/m3,在土壤中達1~500*108個/g，在嚴重污染的水中可達107個/mL。( 飲用水要求細菌總數≤100個/mL,大腸桿菌≤3個/mL。經水塔或貯水池貯存后，短期內可繁殖至105~106個/ml。)人的頭皮上有140萬個/cm2，兩手上約有4~40萬個，1g指甲污垢38億個，1g糞便可達10~1000億個。
可以說微生物是無處不在，無處不有。許多以前被人們認為是極端(高溫、高壓、強酸、強堿、低溫等)甚至是致死的環境，現在已發現生活著各種類型的微生物(稱為極端微生物)。事實說明，微生物有特別頑強的生存、繁殖和變異能力來適應環境。
微生物種類繁多，有的對人有益，有的有害，有的無益也無害。但在藥品生產過程中，不可能對環境中的各種微生物加以區別對待，為保證食品的安全有效，需要對其進行控制。空氣中的微生物多數附著在灰塵上，或以芽孢形式懸浮于空氣中，1μm以下者處于懸浮狀態，10μm以上者會逐漸沉下來而形成菌塵。所以也要對塵粒進行控制。
人是潔凈室最大的污染源，占90%左右。一般男性每人每分鐘向周圍排放1000個以上的含菌粒子，女性為750個以上。穿無菌服時，靜止時的發菌量為10~ 300個/min,一般活動時發菌量為150~ 1000個/min,行走時發菌量為900~ 2500個/min。咳嗽一次發菌量為70~700個/min,噴嚏一次為4000~60000個/min。所以在潔凈室中，人的數量和活動應有特別嚴格的限制。
二、微生物簡介
微生物在自然界中的分布極為廣泛，空氣、土壤、江河、湖泊、海洋等都有數量不等、種類不一的微生物存在。在人類、動物和植物的體表及其與外界相通的腔道中也有多種微生物存在。
絕大多數微生物對人類和動、植物的生存是有益而必需的。自然界中氮、碳、硫等多種元素循環靠微生物的代謝活動來進行。例如空氣中的大量氮氣只有依靠微生物的作用才能被植物吸收，土壤中的微生物能將動、植物蛋白質轉化為無機含氮化合物，以供植物生長的需要，而植物又為人類和動物所利用。因此，沒有微生物，植物就不能新陳代謝，而人類和動物也將無法生存。
另一方面，中極少數微生物引起的傳染病發病快、死亡率高、傳播迅速、傳播范圍廣，嚴重危害著人民健康。
微生物是廣泛存在于自然界的一群體形微小 (直徑小于1mm)、結構簡單、肉眼看不見，必須借助光學或電子顯微鏡放大數百至數萬倍才能觀察到的生物。需要說明的是，微生物是一個比較籠統的概念，界線有時非常模糊。如單細胞藻類和一些原生動物也應算是微生物，但通常它們并不放在微生物中進行研究。
微生物具有以下特點:①體積小，面積大;②吸收多，轉化快(2000倍體重/h) ;③生長旺，繁殖快(20min分裂一次) ;④易變異，適應強;⑤分布廣，種類多(10萬種以上)。
微生物按其結構、化學組成及生活習性等差異可分成三大類:
1.真核細胞型
細胞核的分化程度較高，有核膜、核仁和染色體;胞質內有完整的細胞器(如內質網、核糖體及線粒體等)。真菌屬于此類型微生物。
2.原核細胞型
細胞核分化程度低，僅有原始核質，沒有核膜與核仁:細胞器不很完善。這類微生物種類眾多，有細菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體和放線菌。
3.非細胞型
沒有典型的細胞結構，亦無產生能量的酶系統，只能在活細胞內生長繁殖。體積微小，能通過除菌濾器。病毒屬于此類型微生物。
三、微生物的形態結構
1.細菌(原核單細胞生物)
細菌按形狀可分為:球菌(0.5~2μm) 、桿菌(長1~5μm， 寬0.3~1μm) 和螺形菌(大小與桿菌相似)。
按革蘭氏染色法染色的不同，分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。革蘭氏陽性菌的細胞壁表面含較多的磷壁酸，會產生外毒素，如金黃色葡萄球菌;革蘭氏陰性菌的細胞壁表面多含脂蛋白和脂多糖，會產生內毒素(即熱原)，如大腸桿菌。
細菌一般有細胞壁、細胞膜、細胞質、細胞核，有的還有莢膜、鞭毛、菌毛和芽胞等特殊結構。
細菌一般為無性繁殖，以二分法繁殖，兒十分鐘或1~2小時分裂次。
資料:關于芽孢
在溫度逐漸降低或營養缺乏時，芽胞桿菌屬(如炭疽桿菌)及梭狀芽胞桿菌屬(如破傷風桿菌)能在菌體內形成一個折光性很強的不易著色小體，稱為芽胞，芽胞是處于休眠狀態的細菌，并非細菌的繁殖體，當環境適宜時，可恢復生長繁殖。
芽胞在自然界分布廣泛，要注意防止污染。芽胞的抵抗力強，對熱力、干燥、輻射、化學消毒劑等理化因素均有強大的抵抗力，用一般的方法不易將其條死。有的芽胞可耐100C沸水煮沸數小時。
殺滅芽胞最可靠的方法是高壓蒸汽滅菌。當進行消毒滅菌時往往以芽胞是否被殺死作為判斷滅菌效果的指標。
2.霉菌(絲狀真菌的通稱，真核多細胞生物)
霉菌是真菌的一部分。在培養基上長成絨毛狀或棉絮狀的菌絲體的真菌統稱為霉菌。
霉菌細胞呈狹長的管狀，稱為菌絲，菌絲直徑比細菌、放線菌大，約2~10um。菌絲分枝連接，交錯集合在一起的總體稱為菌絲體。
霉菌大多數是多細胞微生物，菌絲細胞由細胞壁、細胞膜、細胞質、細胞核和各種細胞器組成。細胞壁很薄，往往在表面產生色素，使菌落出現各種顏色。
霉菌靠孢子繁殖，有無性繁殖和有性繁殖兩種方式，以無性繁殖為主。有些真菌可用釀酒造醬，或用于發酵生產檸檬酸、葡萄糖酸、酶、抗生素(如青霉素、頭孢菌素) ;少數真菌能引起各種真菌病。真菌產生的真菌毒素(如黃曲霉素)有毒。
3.酵母菌(真核單細胞生物，屬真菌)
酵母菌以單細胞存在，呈圓形、卵圓形和香腸形，比細菌天，細胞長5~ 30um,寬1~5um。細胞結構有細胞壁、細胞膜、細胞質、細胞核和各種細胞器等。
酵母菌的增殖分無性繁殖和有性繁殖兩個階段，有三種方式:芽殖、裂殖、孢子生殖。
酵母菌是重要的工業微生物，用于釀酒，生產單細胞蛋白、B族維生素、核酸、輔酶A、細胞色素C等。一般對人體無害。
4.放線菌(原核單細胞生物)
放線菌有生長發育良好的菌絲體，呈分枝狀，菌絲寬為0.2~1.2um,革蘭氏陽性。其內部構造與細菌相似，無完整的細胞核。菌落常星幅射狀，因此稱放線菌。
繁殖方式為無性孢子 繁殖。最適pH6.7~7.5, 溫度25~ 30°C。
放線菌可用于生產抗生素、維生素和酶類，少數可引起人畜放線菌病。
5.病毒
病毒是一類體積十分微小，結構簡單，只含一種核酸(DNA或RNA)，沒有產生能量的酶系統，只能在活細胞內以復制方式增殖的非細胞型微生物。病毒在自然界分布非常廣泛，在所有其它生物中都有病毒寄居。病毒是最常見的致病微生物，人類傳染病中大約75%是由病毒引起的。
病毒體主要由核酸和蛋白質組成。病毒體積微小，最大直徑300nm (如牛痘病毒)，最小直徑20nm(如口蹄疫病毒) ，絕大多數在150nm以下，能通過細菌濾器，用普通光學顯微鏡看不見，必須用電子顯微鏡放大數千至數萬倍才能看見。形態多呈球形，少數為桿狀或磚形。噬菌體(細菌病毒)有呈蝌蚪狀的。
四、微生物的營養
1.水分:
水占細胞漿的70%~ 90%，是細胞的重要組成成分。較普遍的觀點認為:只有在含水的環境中微生物才能存活。但也有人發現在無水碳氫化合物中微生物可長期存活。
2.碳源:
碳源是構成細胞的重要物質。有些微生物的碳源必須來自有機碳化合物如糖、蛋白質、脂肪、有機酸等(同時利用其化學能)，屬異養型;有些微生物不需有機碳化合物，以CO2為碳源，屬自養型(分為光能自養型和化能自養型)。
3.氮源:
氮是組成蛋白質和核酸的重要元素。
4.無機鹽類:
細菌所需無機鹽包括磷、硫、鎂、鐵、鉀、鈉、鈣、氯、錳、鋅、鉆、銅等。其中磷、硫、鎂、鉀、鈉、鐵需要量較多，其他只需微量。
5.生長因子:
生長因子是某些微生物生長發育所必需，而其自身又不能合成的一類營養物質包括維生素、嘌呤和嘧啶等。
五、微生物生長的影響因素
1.營養物：
2.pH值:
各種微生物都有其最適宜的pH值，大多數細菌最適pH6.8~7.4，但一般有較大的容忍度，在4~9也可存活和生長，少數細菌能在極端pH值范圍內生長。真菌適于pH值3~6的微酸性環境，但在2~10也可生長。
3.溫度:
微生物適于生長繁殖要有適宜的溫度，當超過其最低或最高可耐受的溫度時，即停止生長或死亡。一般細菌最適溫度為30~40℃，真菌為20~30℃。
4.氧氣:
大多數細菌和所有霉菌都是需氧菌(在有氧環境中才能生長)，少數細菌是厭氧菌(在無氧環境中才能生長)，有些細菌和酵母菌是兼性需氧厭氧的，在有氧或無氧環境中都能生長繁殖。
5.滲透壓:
微生物細胞膜和所有生物膜一樣是一種半透膜，可讓水自由通過，對溶質則有選擇性。由于細胞壁的保護，微生物能存活在低滲透壓的水中。而在高滲溶液(如高濃度的鹽溶液或糖溶液、40%甘油)中，細胞會脫水并停止生長繁殖。但也有一些專性耐高鹽細菌只有在高鹽(10~15%)條件下才生長。
6.表面張力:
表面活性劑可降低表面張力它是影響細菌生長的因素之一。很多革蘭氏陰性菌，特別是大腸菌群可很好地在表血活性劑包圍的介質中生長，而大多數革蘭氏陽性菌在表面張力低時(0.05N/m)不能很好生長。陽離子表面活性劑對很多有機體有毒性，陰離子表面活性劑毒性很小，非離子表面活性劑幾乎沒有毒性，并可成為某此微生物的營養物。
六、消毒與滅菌
消毒和滅菌兩個詞在實際使用中常被混用，其實它們的含義是有所不同的。消毒是指應用消毒劑等方法殺滅物體表面和內部的病原菌營養體的方法，而滅菌是指用物理和化學方法殺死物體表面和內部的所有微生物，使之呈無菌狀態。
（一）消毒是指殺滅或清除傳播媒介上的病原微生物，使之達到無害化的處理。根據有無已知的傳染源可分預防性消毒和疫源性消毒；根據消毒的時間可分為隨時消毒和終末消毒。
（二）滅菌是指殺滅或清除傳播媒介上的所有微生物（包括芽胞），使之達到無菌程度。經過滅菌的物品稱“無菌物品”。
消毒與滅菌是兩個不同的要領。
滅菌可包括消毒，而消毒卻不能代替滅菌。消毒通常用于實驗室檢測環境、人員手部等，滅菌通常用于檢測用具、檢測試劑等。
常用滅菌法
1、干熱滅菌法
常見的有火焰、燒灼、干烤和紅外線滅菌等。
①火焰、燒灼:通常用于實驗室無菌操作中金屬或其它耐火材料制成的器具的滅菌。
②干烤和紅外線:利用干熱空氣或熱輻射進行滅菌。一般135~ 145℃需3~5h, 160~ 170℃需2h以上，170~ 180℃需1h以上，180~ 200℃需0.5~1h。除熱原則需250℃ 30min,或200℃ 45min, 180℃ 2h。
空氣傳熱慢，穿透力不強，故干熱滅菌時間長。
干熱滅菌時烤箱內裝入物品應留有空隙，以利空氣流動，否則使箱內溫度不均，部分物品滅菌不徹底。
2、濕熱滅菌法
通過熱蒸汽或沸水使蛋白質變性而殺滅微生物的方法。濕熱穿透力強，滅菌效果較干熱好。
①煮沸或流通蒸汽滅菌:常壓下沸水和蒸汽的溫度是100℃，般處理30~60min可殺死細菌繁殖體，但不能完全殺滅芽孢。此法適用于不能高壓蒸汽滅菌的物品。
②低溫間隙滅菌(巴斯德滅菌法)：將物品先用60~ 80℃加熱(或煮沸) 1h, 然后置20~25℃保存24h(或常溫過夜)，使其中殘存的芽孢萌發成繁殖體，再用以上條件滅菌，如此反復三次。本法適用于不耐高溫或高溫下易變質的物品，但很費時。
③高壓蒸汽滅菌(熱壓滅菌法) :超過一個大氣壓時，水的沸點高于100℃，反之亦然。
高壓蒸汽滅菌就是通過加壓提高蒸汽溫度，滅菌效果最好。它簡便、經濟、可靠、無毒，是最可靠、應用最廣泛的滅菌法。此法適用于耐高溫和潮濕的物品。常用條件為:
115.5℃ 30min
121.5℃ 20min
126.5℃ 15min
注意事項:
a.必須完全排出滅菌器內的空氣。否則會影響滅菌器內溫度達到規定的要求。
b.注意被滅菌物品的溫度。滅菌器內溫度與被滅菌物品的溫度般是一致的，但在蒸汽輸入過快時，后者可能低于前者，所以升溫時要有一定的預熱時間。另外，降溫過快易引起玻璃炸裂。因此，對于一種滅菌產品，應制定固定的滅菌曲線(象凍干曲線樣)。
c.定期檢查滅菌器內溫度的準確性。
3、化學滅菌法
利用化學試劑形成的氣體來殺滅微生物的方法。常用的滅菌劑為環氧乙烷(又稱氧化乙烯)。
4、濾過除菌法
利用細菌不能通過致密具孔濾材的原理，除去對熱不穩定的藥品溶液或液體物質中的細菌的方法。過濾法般只能除菌，不能除去支原體和病毒。
過濾除菌的效果與濾膜的性能、孔徑的大小、密度、濾膜的厚度等因素有關。
濾過除菌法要求最終過濾的濾膜孔徑為0.22pm。由于各廠家生產的相同規格的濾膜質量并不一致，為了保證除菌效果，在使用前后應檢查濾器的完好性(如壓力維持試驗或起泡點試驗)。一個過濾器的使用時間應根據品種驗證后確定，一般不應超過8小時。
5、輻射滅菌法
輻射有兩種類型:一種是電磁波輻射，如紫外線、紅外線、微波;一種是電離輻射，如可引起被照射物電離的X射線、y射線。
①紫外線:紫外光波長在136~ 390nm之間，其中260nm左石能破壞核酸，殺菌作用最強。
另外，空氣中的氧受紫外線照射后，可微量轉變為臭氧共同起殺菌作用。紫外線消毒的效果與光源的功率、光源與被照射物的距離、照射時間、溫度和濕度等因素有關。我國規定紫外燈照射強度在距離1m處不低于70pW/cm2(以紫外線測強儀測定)
在操作面上要求強度達40μW/cm2以上。一般每10m2裝30W燈管1支，工作前開30~ 60min。紫外燈的輸出功率隨使用時間增加而降低。國產紫外燈的平均壽命(點到70%額定功率的時間)一般為2000h,超過平均壽命時，就達不到預期效果，必須更換。
紫外線的穿透力很弱，不能穿透一般包裝材料，如玻璃、塑料薄膜、紙等。玻璃能強烈吸收小于350nm的紫外線，石英玻璃能吸收小于200nm的紫外線。因此，它主要用于空氣和物體表面消毒，特制的紫外燈裝置也可用于水的消毒。
②紅外線:通過加熱碳化硅板產生的輻射熱能，由空氣傳導加熱滅菌。如紅外線烤箱，溫度可達180℃左右。熱效應特點是由表及里。
③微波:微波滅菌主要是因其熱效應。微波加熱升溫快，溫度高且均勻，殺菌作用強。熱效應特點是由里及表。不同性質的物品吸收微波的能力不同，其熱效應和消毒效果也不同。
微波有一定穿透力，但不強。微波對人體有害，要注意防護。
④60Co滅菌:放射性同位素60Co (或137Cs)衰變時可放射出y射線，p射線的能量高、穿透力強，可使細胞內各種活性物質發生化學變化，從而使細菌損傷或死亡。經60Co輻射滅菌的物品溫度升高很少，一般僅約5℃，故又稱“冷滅菌”
60Co輻射存在兩個方面的安全問題:一是輻射的直接作用。y射線對人體細胞同樣有害;二是經過輻射的食品、藥品的安全性。1984年美國農業部食品安全實驗室用輻射處理的雞肉喂飼小鼠，發現患**腫瘤增加，包括加重癌病損害。因此60Co輻射用于食品和藥品都應經過安全試驗，進行科學的、全面的評價，高劑量的輻射藥品更應慎重。
美國藥典規定25kGy為有效滅菌劑量。1997年我國衛生部頒發了60Co中藥滅菌標準，該標準限國內流通中藥可用60Co輻照滅菌，規定了允許輻照的藥材和中成藥的品種和劑量。
六步洗手法
科學的六步洗手法是在平時防止交叉污染的關鍵。現做以下介紹:
第一步：掌心相對，手指并攏相互進行摩擦。
第二步：手心對手背沿指縫相互進行搓擦，交換進行。
第三步：掌心相對，雙手交叉沿指縫相互進行摩擦。
第四步：一只手握住另一只手的大拇指進行旋轉搓擦，交換進行。
第五步：彎曲各手指關節，在另一手掌心進行旋轉搓擦，交換進行。
第六步：一手指尖在另一手掌心進行轉動，交換進行。
注意要全程用流水清洗。
人員無菌意識培訓
1、GMP對衛生的要求
人是永不休止的恒定污染源
人體自身產生的微粒、微生物
人體攜帶的微粒、微生物
運動、操作等產生的污染
人員不能滅菌除菌，
人員不能消毒,
人是污染潔凈室的主要威脅
2、穿無菌衣時，靜止時的發菌量為10~300個( min/人)
進入潔凈室的人員必須按要求更衣(戴口罩、戴無菌手套等)
對鏡進行整衣，盡可能的包裏身體的全部以減少發菌量和發塵量。
減少走動，活動幅度要小，拿東西要輕拿輕放
不按規定進行著裝的人員、未按規定清潔的物品禁止進入潔凈區。
生產人員不得裸手直接接觸藥品, A級潔凈區內操作人員不得裸手操作,并定時消毒。
其他操作人員以及稱量人員一定要有無菌意識操作,戴手套后不得任意接觸其它物品,按規定進行手消毒。
